靶向p53信号通路的抗肿瘤药物研发策略盘点(下)

The p53 signal pathway

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p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。不同于传统的肿瘤因子在人类癌症中通常表达量下调或存在基因删除的状况，p53在绝大多数肿瘤细胞中会发生突变。对不同人类癌症细胞进行基因组测序的结果表明，在所有恶性肿瘤中50%以上会出现该基因的突变。

Strategies to target mutant p53 in cancers

 

针对于p53突变型肿瘤领域的药物研发，最直接的思路是诱导突变型p53蛋白的降解或帮助其恢复野生型的功能。进一步的研究表明，突变型的p53蛋白还会产生一些致癌性功能(GOF突变，gain-of-function)，从而增加了肿瘤细胞的侵袭、迁移能力及药物抗性产生的概率。因此，p53蛋白的突变对癌症的发展过程起着双重作用，一方面丧失了肿瘤抑制活性；另一方面突变后的蛋白会产生新的癌基因活性，从而促进了肿瘤的发展。而这一特性，使得p53成为肿瘤治疗中靶点选择的热门候选之一。根据设计思路的不同，候选药物可分为直接作用于突变型p53及间接作用于突变型p53蛋白两大类，笔者已在上篇中对恢复p53野生型活性及诱导突变型p53蛋白降解两种直接药物作用策略做了简要论述。

 

合成致死策略是目前抗肿瘤药物研发中一个非常重要的思路。考虑到p53在多种肿瘤细胞中高频出现以及高突变率的存在，寻找该信号通路相关的合成致死性信号通路或候选基因尤为重要。靶向于这类基因或信号通路的药物将会选择性杀死表达有突变型p53分子的肿瘤细胞，而对表达野生型p53的正常细胞不具有细胞毒性。本文将对与突变型p53具有合成致死活性的一些靶基因及信号通路做一简要综述，它们多集中于细胞周期信号通路或一些关键的激酶信号通路。

靶向G2/M期检查点

当p53基因突变时，p53的G1期阻滞功能消失，使细胞完全依赖于G2/M检查点进行DNA修复。因此，通过抑制控制G2/M检查点相关的基因或信号通路，有望在p53突变的肿瘤细胞中诱导合成致死效应。目前几类G2/M检查点调节因子，如CHK1/2、MK2、PLK1及WEE1等有望成为p53突变的肿瘤细胞的重要药物靶点。

CHK1/2

细胞周期重要调控因子之一。在p53突变的肿瘤细胞中，通过抑制ATR/CHK1活力，可以诱导G1及G2/M期细胞周期检查点功能的丧失，从而导致细胞死亡。在临床前研究中，UCN-01可同一些破坏DNA的药物如irinotecan等产生协同作用，后者属于拓扑异构酶I抑制剂。其他具有较好的活性剂更高选择性的CHK1抑制剂类化合物还包括PF477736、A-690002及SCH900776等。这些化合物可以特异性增强p53突变细胞株中拓扑异构酶抑制剂的活性。而近期的一项研究发现，AZD7762，一类具有很高选择性的CHK1抑制剂，在小鼠肿瘤模型中同irinotecan联用可抑制肿瘤细胞生长，延长小鼠存活期；同时还可克服携带有p53突变的头颈部肿瘤对顺铂类化疗药物的抗性。

MAPKAPK2

MK2

全名MAPKAP kinase 2，是另一类重要的G2/M检查点调节因子。研究人员采用RNAi的方式，确认了MK2与p53之间的合成致死效应。在p53缺陷型MEF中，敲低MK2的表达水平能够显著提高细胞对于顺铂及拓扑异构酶Ⅱ抑制剂doxorubicin细胞毒性的敏感性。与此相对，在不含p53突变的肿瘤细胞中，MK2功能的丧失，并不能增加细胞的死亡率或提高其对化疗的敏感性。进一步的机制研究发现，MK2基因的删除可显著降低Cdc25A及Cdc25B的磷酸化水平。综合现有研究结果，在p53功能缺陷或存在突变的肿瘤细胞中，通过抑制MK2活性可以提高化疗药物如顺铂等的敏感性。

PLK1

PLK1 (Polo-like Kinase 1)属于Polo样激酶家族，是一类广泛存在于真核细胞中的丝氨酸/苏氨酸激酶。PLK1激酶可通过其激酶活性与多种底物相互作用，调节细胞有丝分裂、胞质分裂、DNA损伤应答、发育等过程。PLK1与突变型p53存在合成致死效应。研究发现，小分子抑制剂BI-2536对PLK1活性的抑制能够显著提高离子辐射带来的细胞毒性，这一现象仅发生于携带有p53突变的肿瘤细胞系中。尽管采用PLK1抑制剂作为单独治疗方案的临床试验已经终止，二代PLK1抑制剂GSK461364已经在p53突变的肿瘤细胞中展现出更强的选择性和敏感性。

WEE1

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族中的一员，可以使CDK1的Thr14和Tyr15磷酸化而抑制CDK1激酶活性，从而抑制细胞进入有丝分裂。功能分析表明，WEE1对p53突变的头颈部鳞状细胞癌细胞的生存至关重要。WEE1与突变型p53间存在合成致死效应，WEE1选择性抑制剂MK-1775可以使得p53突变的肿瘤细胞对顺铂类DNA损伤化疗药变得敏感。MK-1775同卡铂及紫杉醇联合用药曾在p53突变的卵巢癌患者中开展一期临床研究。

靶向激酶相关信号通路

Structure of the PAK3 protein

SGK2/PAK3

两类蛋白激酶，当宫颈癌细胞株中的p53被HPV感染导致失活后，同p53的功能异常间存在合成致死效应。两者具有不同的作用机制：SGK2的失活会诱导细胞自噬过程的发生；而PAK3功能失活则会导致细胞凋亡的发生。尽管如此，两者同p53功能异常的合成致死效应是否同他们的激酶活性相关，仍有待探索。

MPS1

全称Monopolar Spindle 1 kinase，在纺锤体装配检查点中扮演重要作用，参与调节染色体固着等有丝分裂相关过程。研究发现，丝苏氨酸激酶抑制剂SP600125会选择性杀伤p53功能缺失的细胞，其细胞毒性具有p53依赖性。在乳腺癌细胞系中，研究人员同样发现了SP600125对MPS1的抑制作用会选择性诱导p53突变的细胞死亡。除此之外，MPS1的功能抑制还可使得乳腺癌细胞对于传统的化疗方案变得敏感。因此，在p53突变的结肠癌及乳腺癌中，MPS1是一个非常有潜力的药物靶点。

Overall structure of PI5P4Kβ in complex with nucleotide

PI5P4Kβ

p53分子可通过调节线粒体呼吸过程，限制活性氧化物而维持细胞内的代谢平衡，从而使得细胞能够存活下去。近期研究发现，当PI5P4Kβ活性受到抑制时，p53突变的乳腺癌细胞会由于葡萄糖代谢受到抑制以及ROS水平的升高而增殖水平降低。PI5P4Kβ基因在乳腺癌中往往存在基因扩增，且通常会伴随着p53的突变同时发生。在p53缺陷的乳腺癌细胞中敲除PI5P4Kβ基因会导致肿瘤细胞生长受到抑制。上述研究表明，PI5P4Kβ抑制剂能有效治疗p53突变型的癌症。

靶向对p53突变的肿瘤细胞生长至关重要的信号通路

p38

p38丝裂原蛋白激酶家族是一个在真核生物中高度保守的激酶家族。p38参与的信号通路在细胞应激反应中起着极其重要的作用。几乎所有不良的的外部刺激和内部变化均可以激活所有类型细胞中的p38信号通路，因此该信号通路是一条主要的应激激活信号通路。近来发现它在多种肿瘤，包括宫颈癌、卵巢癌、肝癌、淋巴瘤中，与凋亡的启动、细胞周期的静止等密切相关，并且具有细胞特异性，在不同肿瘤细胞作用并不相同，甚至起了完全相反的作用。在肿瘤细胞恶性转化阶段，p38通过磷酸化激活p53，起到抑癌基因活性，使得细胞周期停滞并进入细胞凋亡过程。但在乳腺癌及肝癌患者中，p38表达量的上升却与较差的生存率相关，表明p38扮演了促癌基因的角色。事实上，抑制p38活性可特异性抑制携带有p53突变体的乳腺癌细胞的生长。另有研究表明，抑制p38活性可以使得乳腺癌细胞对顺铂变得敏感而进入细胞凋亡过程。因此，通过小分子抑制剂来靶向p38有望成为携带有p53突变的高侵袭性三阴性乳腺癌的有效临床治疗措施。

Structure of the DAPK1 protein 

DAPK1

全称death associated protein kinase 1，是一类钙离子、钙调蛋白调节的蛋白激酶，在INF-γ、TNF-α及TGF-β等因子刺激时激活死亡信号。近期研究表明，DAPK1对携带有p53突变的肿瘤细胞的生长至关重要，且在约80%的三阴性乳腺癌中存在过量表达。因此，靶向DAPK1分子有望成为治疗存在p53突变的癌症的一类新策略。

The curved leucine-rich repeat region of toll-like receptors, represented here by TLR3 

TLR

Toll样受体在机体响应不同入侵病原体并激活早期先天免疫系统，以及刺激后天获得性免疫反应中扮演重要角色。目前已知至少两类TLRs、TLR4和TLR3与p53突变型肿瘤相关。TLR4表达于免疫细胞表面，在受到革兰氏阴性细菌脂多糖刺激时激活先天免疫反应。TLR4同样表达于乳腺上皮肿瘤中，能够促进肿瘤细胞生长及抗药性的产生。因此，TLR4已成为靶向免疫系统药物开发的重要靶点。近期的一项研究表明，TLR4信号的激活在p53突变的乳腺癌中可以促进细胞生长，而在p53野生型的乳腺癌中却能抑制细胞增殖。两者功能的巨大差异，来源于TLR4激活后所介导分泌的肿瘤细胞因子不同所致。在p53野生型乳腺癌肿瘤细胞中，TLR4激活会增加INF-γ的分泌，进而导致p21表达量上调及对肿瘤的抑制效应；而在p53突变的乳腺癌肿瘤细胞系中，TLR4信号的激活会诱导CXCL1和CD154的分泌，从而促进细胞增殖。上述发现表明，在进行靶向TLR4的治疗时，需要对p53的状态进行严格评估。

靶向p53获得性功能(GOF，gain of function)相关信号通路

统计数字表明，绝大多数肿瘤细胞中存在p53基因的错义突变，而不是基因删除，也从一个侧面反映出携带有突变型p53分子的细胞较之p53缺失的细胞更具有生存优势性。尽管突变的位点贯穿整个p53分子，但高频出现区域为p53的DNA结合结构域，这其中又有六个主要位点，分别为R175，G245，R248，R273，R282及R213。越来越多的数据证实，p53突变不仅会导致某些转录活性的丧失，同时还会获得一些促进癌症产生、发展的功能。定位于细胞质中的p53突变体可以通过激活mTOR信号而有利于肿瘤细胞的存活。而p53突变体同样还可以激活细胞迁移相关的信号通路，如RhoA/ROCK，EGFR/integrin再循环，Myo10，Pla2g16等促进癌症的侵袭和转移。因此，靶向p53突变体的各类获得性功能，有望为治疗携带突变型p53肿瘤的药物研发提供一个新的视角。

靶向p53突变体获得性功能之mTOR信号通路：

Signaling pathway of mTOR

自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。研究数据证实，细胞自噬在肿瘤发生过程中起到抑癌活性。近期几项研究发现，定位于细胞质中的某些特定类型的p53突变体(R175H，R273H，R273L)，可通过阻塞AMPK信号或者激活Akt/mTOR信号而获得抑制细胞自噬过程的新功能。机制研究证实，这些胞质中的p53突变体通过抑制一些关键的自噬相关蛋白及酶，如BECN1，DRAM2和ATG12等的活性而阻止自噬囊泡的形成及与溶酶体的融合过程。AMPK的活化可通过诱导生物大分子的降解来诱导细胞自噬的发生；而mTOR信号则通过促进肿瘤细胞生长的代谢合成抑制细胞自噬的发生。胞质中的p53突变体通过抑制自噬过程而增加了肿瘤细胞的增殖和存活。因此，靶向mTOR信号通路来诱导细胞自噬的产生，有望成为治疗携带有某些特定的胞质p53突变肿瘤的策略之一。

靶向p53突变体获得性功能之肿瘤侵袭相关信号通路：

RhoA/ROCK信号通路

Warburg效应是由德国生物化学家奥托·沃伯格于1930年发现的。大多数肿瘤细胞在有氧条件下仍表现活跃的葡萄糖摄取和糖酵解，这种现象被称为Warburg效应或需氧糖酵解。Warburg效应有利于肿瘤生长，并与一些抗药性有关。不同的研究小组分别发现，p53^R172H型突变能够增加RhoA/ROCK信号通路活性；而在体内试验中，目前已用于临床的激酶抑制剂dasatanib可抑制RhoA活力及p53^R172H型肿瘤细胞的侵袭能力。以上研究表明，在p53突变的肿瘤细胞中靶向抑制RhoA/ROCK信号通路活性有望抑制肿瘤的发生过程，甚至肿瘤细胞的转移。

 

EGFR/integrin再循环过程

在2009年发表的一项研究中，科研人员发现p53^R172H型和p53^R172H突变可以使得EGFR与integrin α5β1再循环回细胞表面，从而增加了肿瘤细胞侵袭和转移的可能。P53突变导致的integrin/EGFR再循环与p63的转录抑制相关。因此，p53与p63功能的缺失可在表型上部分模拟p53突变的肿瘤细胞。尽管突变型p53如何抑制p63活性的机制尚不清晰，但现有研究结果表明，抑制integrin α5β1及EGFR信号通路将会有助于治疗携带有p53获得性功能突变的癌症。

 

PDGFRβ信号通路

血小板衍生生长因子受体β，主要表达于基质细胞中，同肿瘤的侵袭和转移相关。近期的一项研究发现，PDGFRβ在携带有Kras^G12D及P53^R172H的小鼠模型中，可促进胰腺癌的转移；而采用imatinib抑制PDGFRβ活性增能有效预防胰腺癌细胞的侵袭及转移。考虑到超过90%的胰腺癌病例携带有p53突变，阻塞PDGFRβ活性也是治疗该类型胰腺癌的策略之一。

靶向p53突变体获得性功能之细胞和核苷酸代谢：

多项研究表明，p53突变体的获得性功能之一是调节细胞及核苷酸代谢过程。采用3D细胞培养模型，研究人员发现表达p53^R273H或p53^R280K的乳腺癌细胞系可通过上调甲羟戊酸途径而破坏腺泡形态特征，该通路与胆固醇的合成相关。采用临床批准使用的他汀类药物simvastatin处理，可诱导p53^R273H细胞死亡或降低p53^R273H型细胞的侵袭性；机制研究表明，Geranylgeranyl转移酶及SREBPs在其中扮演重要作用。因此，靶向甲羟戊酸途径有望用于治疗p53突变型的乳腺癌。P53突变体的另一项获得性功能报道于头颈部鳞状细胞癌中，可促进肿瘤细胞的代谢过程。在能量压力条件下，p53突变体而非野生型分子，可以通过结合AMPK的α亚基而抑制其激活；该过程会导致细胞代谢检查点的受损，从而增加肿瘤细胞的增长和进展。另外，近期的研究还发现，p53突变体还可影响肿瘤细胞的核苷酸代谢。对p53突变体基因表达水平敲低的乳腺癌细胞进行CHIP-seq分析表明，p53突变体活性的减弱会降低很多核苷酸代谢相关基因的活力及核苷酸池的减少，从而减弱GTP依赖性蛋白质的活力及细胞侵袭能力。

靶向p53突变体获得性功能之表观遗传学改变：

2015年的一项研究发现，p53突变体对染色质的调节可驱动肿瘤细胞的生长及侵袭性，其主要作用方式为改变组蛋白修饰相关的蛋白活性。p53蛋白突变体，而非野生型分子，通过与转录因子ETS2的相互作用而被招募至染色质。该相互作用会导致与表观遗传学相关的酶分子的表达上调，如甲基转移酶KMT2A (MLL1)及KMT2D (MLL2)，以及乙酰基转移酶KAT6A (MOZ)等，从而导致整个基因组水平的组蛋白甲基化及乙酰化水平升高。染色质调节基因，特别是MLL1与p53突变体驱动的细胞增殖相关，采用基因工程或药物学方法抑制MLL1活性会显著降低肿瘤细胞的增殖能力。另外p53突变体还可通过作用于SWI/SNF染色质重塑复合体而上调VEGFR2活性，从而促进肿瘤的发生。综上，p53突变与染色质调节、基因表达间的复杂关系，可以解释为什么如此多的基因会受到p53突变的影响。另外，上述发现也提示了设计基于表观遗传学过程的靶向药物，对治疗带有p53突变的肿瘤患者的新机遇。

靶向p53突变体获得性功能之耐药性：

越来越多的证据表明，p53突变体的获得性功能通过不同作用机制介导了肿瘤细胞的耐药性，包括抑制凋亡蛋白活性及对基因进行调节等。早期研究发现，p53突变与顺铂、阿霉素及紫杉醇等化疗药物的耐药性相关。p53^R273H最早被证实可通过下调procaspase-3水平而诱导产生阿霉素耐药性。进一步研究发现，p53^R248Q通过上调P-糖蛋白水平而导致对阿霉素和紫杉醇的交叉耐药性；该蛋白在多重耐药性肿瘤细胞中会降低药物的累积水平，从而导致耐药性的产生。因此，P-糖蛋白抑制剂同阿霉素联用，有望克服p53突变体带来的耐药性。TDP2，一类与化疗药物etoposide引发的DNA损伤修复相关的DNA磷酸二酯酶，是p53突变体的转录激活靶点；抑制其活力可以使得细胞对etoposide在肺癌中的药物治疗变得敏感。考虑到p53突变体与TDP2在肺癌中存在高频的过表达，后者有望成为p53突变型肺癌中增加化疗药物敏感性的重要成药性靶点。

 

参考文献：

1.http://p53.free.fr/

2.Molecularly targeted therapies for p53-mutant cancers.Cell Mol Life Sci. 2017 Jun 22. doi:10.1007/s00018-017-2575-0

3.Allele-specific p53 mutant reactivation.Cancer Cell, 2012, 21 (5): 614

4.http://criticaloutcome.com/coti-2-and-pipeline/pipeline/

5.p53 in health and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Apr;8 (4):275-83.

6.p53 insurvival, death and metabolic health: a lifeguard with a licence to kill. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015 Jul;16 (7):393-405. doi: 10.1038/nrm4007.

7.Awakening guardian angels: drugging the p53 pathway. Nat Rev Cancer. 2009 Dec;9 (12):862-73. doi: 10.1038/nrc2763.

8.The p53 Pathway:Origins, Inactivation in Cancer, and Emerging Therapeutic Approaches. Annu Rev Biochem. 2016 Jun 2;85:375-404. doi: 10.1146/annurev-biochem-060815-014710.

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