CD8+ T cells regulate tumor ferroptosis during cancer immunotherapy
（Nature. 2019 May ; 569(7755): 270–274. ）
Abstract
肿瘤免疫治疗是恢复和/或增强肿瘤微环境中CD8+ T细胞的效应功能。肿瘤免疫治疗激活的CD8+T细胞主要通过穿孔素-颗粒酶和Fas/FasL途径诱导细胞死亡来清除肿瘤。铁死亡是一种不同于细胞凋亡的细胞死亡形式，是由铁依赖的脂质过氧化物积累所致。虽然它是机械的体外阐明，新证据表明，铁死亡可能涉及各种病理情况。然而，铁死亡是否参与T细胞免疫和癌症免疫治疗尚不清楚。在这里，作者发现免疫治疗激活的CD8+ T细胞增强了肿瘤细胞中铁死亡特异性的脂质过氧化，反过来，铁死亡的增加有助于免疫治疗的抗肿瘤效果。从机制上看，CD8+T细胞释放的IFN-γ下调谷氨酸-胱氨酸反向转运蛋白系统xc-的两个亚基SLC3A2和SLC7A11的表达，抑制肿瘤细胞胱氨酸摄取，从而促进肿瘤细胞脂质过氧化和铁死亡。在临床前模型中，通过cyst(e)inase消耗cyst(e)ine联合检查点阻断协同增强T细胞介导的抗肿瘤免疫并诱导肿瘤细胞铁死亡。系统xc-的表达与CD8+ T细胞特征、IFN-γ表达和癌症患者预后负相关。在尼鲁单抗治疗前和治疗期间的转录组分析显示，临床获益与SLC3A2表达减少和IFN-γ和CD8表达增加相关。因此，T细胞促进肿瘤铁死亡是一种新的抗肿瘤机制。以肿瘤铁死亡蛋白途径为靶点，联合检查点阻断是一种有效的治疗方法。
Results
1)为了研究铁死亡是否参与肿瘤免疫治疗的抗肿瘤活性，作者用PD-L1治疗ID8卵巢肿瘤小鼠，并在单细胞中检测铁死亡的功能标记物脂质过氧化。PD-L1阻断治疗导致CD45-ID8细胞中脂质活性氧(ROS)增加(图1a)，但在CD45+细胞中没有，并降低肿瘤生长(图1b)。同样，在B16皮下黑色素瘤模型中，PD-L1阻断增加了CD45-肿瘤细胞的脂质ROS(图1c)，降低了肿瘤重量(图1d)。过继性输注卵清蛋白(OVA)特异性CD8+ T (OT-I)细胞到OVA+ B16荷瘤小鼠中，CD45-OVA- h2kb +肿瘤细胞中脂质ROS也增加(图1e)，但在CD45+细胞中没有增加。通过丙二醛(MDA)实验进一步证实了OT-I转染小鼠肿瘤组织中脂质过氧化的增加。伴随着这些发现，OT-I细胞控制肿瘤生长(图1f)。
为了进一步探索脂质ROS和铁死亡增加是否有助于癌症免疫治疗的疗效，作者构建了Erastinresis ID8细胞，与亲代细胞相比，这些细胞对erastin或RSL3(另一种铁死亡诱导物)的再挑战不敏感，但对阿霉素和吉西他滨这两种凋亡诱导因子仍然敏感。在体内，与亲代细胞相比，Erastinresis ID8细胞未能对PD-L1阻断产生有效响应。同样，在RSL3耐药(RSL3resis) B16细胞中，PD-L1阻断未能增加脂质ROS和降低肿瘤重量。此外，在活体内测试了铁死亡抑制剂liproxstatin-1对检查点阻断效果的影响。发现：抗CTLA-4联合抗PD-L1有效地降低了B16肿瘤的生长，而liproxstatin-1 可以减弱这种作用(图1g)。
作者质疑免疫治疗激活的CD8+ T细胞是否会直接影响癌细胞铁死亡。在OVA+肿瘤细胞与OT-I细胞的共培养中，作者发现激活OT-I细胞增强了B16细胞中的脂质ROS(图1h)，并增强了RSL3诱导的ID8细胞或B16细胞的细胞死亡(图1i)，而liproxstatin-1可以逆转这一过程(图1i)。然而，在RSL3缺失的情况下，liproxstatin-1未能在体外挽救OT-I细胞诱导的OVA+ B16细胞死亡。活化小鼠CD8+ T细胞上清可增加B16和ID8细胞的脂质ROS(图1j)。同样，活化的人CD8+ T细胞上清液增加了HT-1080细胞的脂质ROS(图1k)，并增强了RSL3的毒性，降低了细胞活力，这一作用可通过liproxstatin-1消除。
图1. 免疫治疗激活CD8+ T细胞调节癌细胞铁死亡
2)IFN-γ和TNF-α是效应CD8+ T细胞释放的两种主要细胞因子。发现CD8+ T细胞上清诱导的B16细胞脂质ROS可以被抗IFN-γ抗体消除，而不能被抗TNF-α抗体消除。同样，IFN-γ受体I (IFNGR1)缺陷的B16细胞在OT-I细胞和CD8+ T细胞上清反应中未能增加ROS表达和细胞死亡(图2a, b)。用IFN-γ预处理B16细胞和HT-1080细胞可增加erastin-或者RSL3诱导的脂质ROS (图2 c),增强他们对erastin的敏感性和RSL3，增加RSL3或erastin诱导的细胞死亡(图2d)。当与RSL3结合时，IFNγ进一步增加了HT-1080细胞中氧化PC的含量(图2e)。除了erastin和RSL3外，IFN-γ还增加了其他几种铁死亡诱导剂的细胞毒性，包括ML162、ML210、丁硫氨酸亚砜基胺(BSO)和柳氮吡啶(SAS)。当HT-1080细胞在低浓度胱氨酸中培养时，IFN-γ显著降低了细胞活力，而ferrostatin-1消除了这种影响。在体内，高剂量IFN-γ降低了NSG小鼠HT-1080肿瘤体积，liproxstatin-1消除了IFNγ的抗肿瘤作用(图2f)。与此相一致的是，低剂量的IFN-γ增强了SAS在HT-1080体内的抗肿瘤效果。然后，作者检测了T细胞本身是否对含或不含IFN-γ的铁死亡诱导剂敏感。Erastin或RSL3不影响激活的人和小鼠CD4+和CD8+ T细胞中IFNγ的表达Naïve人和小鼠CD4+和CD8+ T细胞对erastin或RSL3诱导的细胞死亡相对不敏感，而不管IFNγ的启动。erastin或RSL3不会损害激活的人和小鼠CD4+和CD8+ T细胞中IFNγ的表达. Ferrostatin-1对T细胞存活和IFNγ表达无影响。结果提示肿瘤细胞和T细胞对铁死亡诱导剂的敏感性不同。
为了识别细胞铁死亡的生物标志物，作者重新分析了来自癌症治疗反应部分的数据，并评估了654个癌细胞系的基因表达谱与细胞对erastin和RSL316敏感性之间的相关性。作者发现了16个敏感/耐药的生物标志物。其中12个在对铁死亡诱导物耐药的细胞中高表达，4个在对铁下垂诱导物敏感的细胞中高表达。然后，作者将这些铁死亡生物标志物与IFN-γ处理HT-1080细胞后差异表达的基因进行交叉比对。IFN-γ降低了SLC7A11和SLC3A2 mRNA的表达。这一观察结果通过实时PCR和Western blot (Fig. 2g)得到证实。SLC7A11和SLC3A2介导细胞外胱氨酸和细胞内谷氨酸的交换。与此相一致的是，IFN-γ降低了胱氨酸的吸收(图2h)，并协同erastin降低谷氨酸释放。在HT-1080细胞中敲低SLC7A11增加了erastin诱导的细胞死亡(图2i)。
图2. IFNγ通过抑制系统xc使肿瘤细胞对铁死亡敏感
3)Cyst(e)inase，一种工程酶，降解胱氨酸和半胱氨酸，有效地诱导氧化应激并导致细胞死亡。Cyst(e)inase诱导HT-1080细胞戏剧性死亡，这被3种铁死亡抑制剂，ferrostatin-1, DFO或GSH所阻断(图3a)。Cyst(e)inase诱导的细胞死亡通过IFN-γ的启动进一步增强(图3b)。在小鼠ID8和B16细胞中，IFNγ与Cyst(e)inase协同增加脂质过氧化并诱导细胞死亡(图3c, d)。作者使用牛血清白蛋白(BSA)和热灭Cyst(e)inase作为额外的对照，并证实了IFN-γ和Cyst(e)inase对肿瘤细胞的脂质过氧化和铁死亡的特异性调控。然后，作者在体内测试了PD-L1阻断联合Cyst(e)inase的抗肿瘤作用。在单独使用PD-L1阻断剂或Cyst(e)inase的小鼠中，ID8肿瘤生长相对降低，但在联合使用PD-L1阻断剂或Cyst(e)inase的小鼠中，ID8肿瘤生长受到强烈抑制(图3e)。与对照组比，联合治疗显著增加了体内肿瘤细胞的脂质过氧化 (图3)和增强的百分比CD8 +及CD4 + T细胞(图3 g), 同时，提高了肿瘤微环境中IFN-γ的百分比+和TNF-α+ CD8 +及CD4 + T细胞 (图3 h, i)。此外, Cyst(e)inase联合PD-L1阻断的治疗效果被利liproxstatin-1部分逆转。这些结果表明，Cyst(e)inase与检查点抑制剂协同作用，通过诱导铁死亡引发抗肿瘤免疫。
图3 Cyst(e)inase和PD-L1阻断协同诱导铁死亡
4) 接下来，作者量化了人类黑色素瘤组织中浸润的CD8+细胞数量以及肿瘤SLC7A11和SLC3A2的表达水平。CD8+ T细胞浸润较高的肿瘤组织，癌细胞上SLC7A11(图4a)和SLC3A2(图4b)表达水平较低。出乎意料的是，除了肿瘤细胞外，SLC7A11在CD8+ T细胞上也有高表达，而SLC3A2在肿瘤细胞上基本表达。因此，作者将后续的肿瘤RNA测序数据分析集中在SLC3A2上。检查了来自癌症基因组Altas (TCGA)数据库的黑色素瘤患者的基因表达谱。SLC3A2表达水平与CD8+效应T细胞特征和IFN-γ表达呈负相关(图4c，d). Kaplan-Meier生存分析显示，SLC3A2低表达(图4e)和CD8A高表达或IFN-γ高表达与黑色素瘤患者总体生存改善相关。此外，CD8+效应T细胞特征(图4f)或IFN-γ表达(图4g)与铁死亡反应呈正相关。此外，分析了SLC3A2在治疗前和治疗中与PD-1阻断相匹配的黑色素瘤组织中的潜在变化。与没有获益的患者相比，临床获益的患者在治疗开始后，SLC3A2降低，但诱导IFN-γ或CD8A (图4h)。
图4 系统xc-表达与免疫特征和患者预后相关
Discussion
总之，作者在此报告免疫治疗激活的CD8+T细胞通过IFN-γ促进肿瘤细胞脂质过氧化，并使肿瘤对铁死亡敏感。虽然发现在传统的体外培养体系中，T细胞和IFN-γ可以致敏肿瘤细胞，但可能不会直接诱导肿瘤细胞铁死亡，低胱氨酸体外培养和体内数据表明，铁死亡参与了T细胞介导的癌症免疫。因此，除了细胞凋亡和衰老，肿瘤细胞铁死亡是一种以前未被认识到的CD8+ T细胞介导的体内肿瘤清除机制。引发肿瘤细胞铁死亡的内源性机制尚不清楚。文中数据表明胱氨酸限制可能是肿瘤微环境中肿瘤细胞铁死亡的潜在内源性触发器。肿瘤代谢通过诱导T细胞功能障碍和排斥促进免疫逃避。本文工作强调了T细胞诱导的代谢改变可以影响肿瘤细胞的命运这一对立关系。因此，靶向肿瘤铁死亡相关代谢可能提高肿瘤免疫治疗的疗效。
DOI：10.1038/s41586-019-1170-y.
北京大学杨根老师课题组
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