体细胞突变产生新生抗原，近来技术的进展促进了包括针对T细胞受体模拟抗体（TCRmantibody）在内的针对细胞内抗原的治疗方法的开发，本文总结了TCRm抗体特别的靶向新生抗原的TCRm抗体的关键特征，并进一步讨论了开发中必须克服的障碍。
医学之父希波克拉底认为医学的主要目的应该是建立患者自身的抵抗能力，但在面对癌症的时候现在治疗往往又依赖具体的方法而不是疾病本身。个体化的免疫治疗通常提供潜在更持久、高度特性和安全的治疗。免疫治疗研究中很多尝试旨在增强T细胞应答，此外另一个方面就是增强抗体应答。单克隆抗体在治疗癌症上显示出了高效性，但目前抗体治疗主要识别特异性的细胞表面受体或游离配体这两类靶点，而细胞表面分子只占了肿瘤细胞蛋白的一小部分。目前FDA批准的治疗癌症的药物中只有20个不到是靶向细胞表面或者胞外蛋白，下表列出了部分已经在临床上获得验证的细胞表面或者胞外的单抗靶点。靶向胞内蛋白能极大拓展单抗治疗应用范围并让更多患者获益。
Trenevska总结了用单抗靶向胞内抗原的方法。主要的一个就是将单抗运送入细胞，有两个可实现的途径：1）类似基因治疗，在细胞中表达单抗；2）用如纳米颗粒、脂质体或融合细胞穿透肽等载体将单抗运入细胞。另一个主要策略就是靶向外化的胞内蛋白，在少数情况下肿瘤细胞内蛋白会转位到细胞表面或者胞外环境，使得成为单抗的潜在靶点，PRL3和gp75就是这样的例子。
更常见的是，胞内蛋白被蛋白酶体降解成短肽，部分被MHCI复合物呈递在细胞表面，这时肽-MHCI复合物（p-MHC）被CD8+T细胞上的TCR识别。而TCR模拟单抗或TCR类单抗也能识别由MHCI分子和肽段组成的表位。
科学家利用对抗原呈递的理解开发出了新的抗肿瘤治疗策略包括TCR模拟抗体、TCR-T和CAR-T。Trenevska在2017年总结的TCR模拟抗体的信息将其描述成针对细胞内肿瘤抗原的治疗型抗体，另一篇总数进一步的整理了TCR模拟抗体的靶点、方法、挑战和机遇。
本文针对用TCR模拟抗体进行抗肿瘤治疗的策略做了更新和分析，特别是针对现在冉冉升起的明星靶点——新生抗原。本文主要讨论pMHC的分类、肿瘤相关抗原（TAA）的鉴定、制备TCR模拟抗体的方法和该类抗体治疗应用的主要进展。最后展示如何利用上述讨论来理解TCRm的优势以及如何更好的克服开发TCRm治疗的关键障碍。
肿瘤相关性抗原（TAAs）通常指肿瘤产生的，能被包括抗体在内的免疫系统识别的蛋白。pMHC复合物就是被TCR模拟抗体识别的肿瘤抗原。细胞内的抗原加工如下图所示：
细胞内的外源和内源蛋白被蛋白酶体降解加工，产生的肽段被运输到内质网与MHC-I组装成复合物，再通过高尔基体运输最终呈现在细胞表面。基于肽段组分的来源，pMHC复合物可以大致分为三类：肿瘤相关的病毒抗原、肿瘤相关的自身抗原和新生抗原。在一些病毒相关的癌症，如HBV引起的肝癌和HPV引起的宫颈癌中，位于细胞质中的病毒蛋白可以被降解并呈递在细胞表面，这些就是肿瘤相关的病毒抗原。肿瘤相关的自身抗原则是在肿瘤细胞中异常表达的蛋白，如MAGE、NY-ESO-1、WT1、Her2、PSA和MUC1。而新生抗原则是由肿瘤细胞中基因突变产生，被hot免疫系统视作“非自身”组分，因此新生抗原有时候也被称作肿瘤特异性抗原（TSA）。之前多篇综述都共同指出，目前大家对新生抗原的研究兴趣正浓，包括在肿瘤免疫中的角色和应用到个体化免疫治疗上的潜力。在TNBC的研究中发现，免疫细胞浸润高的患者队列相比免疫细胞浸润低的队列伴随着好的预后并显示显著更低的突变及新生抗原数量。而在肺腺癌的研究中，肿瘤细胞中突变驱动的新生抗原表达的高多样性与高的肿瘤浸润T细胞在瘤内异质性（ITH）相关，这些结果提示T细胞库的分布差异可能由肿瘤不同位置的特定新生抗原表达引起，更重要的是研究人员发现高度的TCRITH与复发的高风险及更短DFS正相关。在Nivolumab治疗的黑色素里患者中，缓解较好的患者相比治疗前的基线有着更低的突变和新生抗原负荷，也就是说缓解的患者在Nivolumab治疗后的克隆异质性显著更低，这些结果提示Nivorlumab激活了细胞毒T细胞清除携带高免疫原性的新生抗原的肿瘤。Luksza报道了检查点阻断免疫治疗在黑色素瘤模型中的应答可以基于新生抗原被MHC呈递并被T细胞识别的概率预测。这些看似矛盾的研究提示新生抗原负荷本身并非并不决定患者治疗结果，相反，对新生抗原的热免疫应答才是关键要素。在免疫激活的情况下，更多的肿瘤浸润T细胞意味着杀伤更多携带新生抗原的肿瘤细胞，反过来导致新生抗原数目降低和更好的预后。而在免疫抑制的情况下，肿瘤浸润T细胞没有被激活，而一旦加入检查点抑制剂，T细胞转向活化状态，这时杀伤效应与更高的新生抗原负荷正相关。
为了回答癌细胞如何产生新生抗原的问题，Giovanni在结肠癌、乳腺癌和胰腺癌细胞系中将将DNA修复中的关键基因MLH1失活，发现增加了新生抗原产生，并引起免疫活性小鼠中更差的肿瘤增长。该综述覆盖了当今癌症新生抗原的研究和免疫治疗包括白血病、头颈部癌的在内肿瘤的潜力。目前针对新生抗原开发的治疗策略主要集中在癌症疫苗和基于T细胞的治疗上。TCR模拟抗体优于新生抗原的高度个体特异的，因而先前研究较少。
开发靶向pMHC复合物疗法的关键第一步就是鉴定TAA。70年代早期通过对异种免疫血清的分析鉴定出了癌胚抗原（CEA）和α-甲胎蛋白（AFP）两种TAA。同样也证明了EBV病毒与伯基特淋巴瘤和鼻咽癌之间的相关性。在90年代成功克隆出首个人肿瘤抗原：黑色素瘤抗原-1（MAGE-1），随后研究证明MAGE-1（MAGE-A1）在不同的癌症中都有表达，但是除了睾丸和胎盘外其余正常组织均无表达。鉴定MAGE-A1包括两个步骤，第一步是从外周血分离扩增细胞毒T淋巴细胞（CTL）并用自体肿瘤细胞刺激CTL；第二步用从自体肿瘤细胞构建的cDNA文库载体转染细胞，并用这些细胞反复刺激CTL克隆。用了这两步的方法，就能鉴定出编码相关抗原的基因。这种技术被称作“T细胞表位克隆”，很多研究用来成功鉴定出一些其它肿瘤抗原。后来Pfreundschuh用患者血清中的抗体来代替T细胞来进行肿瘤cDNA表达文库的免疫筛选，这就是“重组cDNA表达文库血清学分析技术”，使得多个新型的免疫原性TAA和高免疫原性肿瘤抗原纽约食管鳞状细胞癌1（NY-ESO-1）被发现。Old和Chen用癌睾丸抗原（CTA）来描述这种在多种组织类型的恶性肿瘤中表达，但是在除了睾丸和胎盘以外的正常组织不表达的基因产物。除了免疫学方法之外，还有其它技术手段来鉴定TAA。首先是反向免疫学，用特定的软件预测能结合人类白细胞抗原复合物（HLA，即人MHC）的基序；其次是生化方法，在洗脱和分离肽段后用质谱分析鉴定出TAA；第三就是DNA微阵列比较肿瘤组织和正常对照的基因表达谱来鉴定TAA。
在2005年之前，因为难以鉴定且个体高度特异，新生抗原并未获得多少关注。但是2008年癌症基因组测序显示体细胞突变在多个肿瘤类型中都很常见，这些证据表明新生抗原在癌症中并不罕见。计算预测显示乳腺癌和结肠癌中的突变生成结合HLA的肽段刺激CD8+T细胞应答。2012年，两个独立的实验室用NGS、生物信息学表位预测和免疫学的组合方法在鼠黑色素瘤细胞和肉瘤细胞鉴定并炎症出明确的TSA。2014年Gubin用基因组学和生物信息学方法在小鼠恶性肉瘤中发现肿瘤特异性突变蛋白是主要的T细胞抗原，引起了接受靶向PD-1和CTLA-4的检查点阻断治疗后的免疫排斥。Yadav报道了在2个广泛应用的小鼠肿瘤模型中，结合全外显子和转录组测序和质谱分析来鉴定信表位，结果显示在人黑色素瘤和NSCLC中，新生抗原负荷与免疫检查点阻断治疗的临床获益显著相关。突变的MHC-II表位也被发现与抗肿瘤的免疫应答相关。
在鉴定出靶点后，制备抗体就是开发TCR模拟抗体治疗的下一个重要步骤。传统的制备方法是用pMHC复合物免疫动物然后制备分离杂交瘤，不管是在表面表达pMHC复合物的抗原呈递细胞（APC）或是纯化的pMHC复合物都可以用作免疫小鼠的抗原。Dadaglio报道用全细胞免疫小鼠后1000个杂交瘤克隆中能筛到1个特异性结合目标pMHC，而另一项研究显示1000个杂交瘤克隆中能筛到4个特异性结合目标pMHC。更多的研究未能获取特异性结合pMHC的抗体，这些案例表明用全细胞免疫动物，即便是优化了条件，能产生肽段特异、MHC限制的抗体是非常罕见的。近来有研究组采用重组MHC/肽复合物来免疫动物并结合高通量筛选数千个克隆，最终成功的分离出少量的TCR模拟受体，表明用重组复合物比全细胞免疫方法效率更高。
1996年Engberg证明用噬菌体展示的方法可以快速高效的分理处具有独特的特异性的抗体。这个方法中，首先要从免疫小鼠的脾脏分离提取总RNA并制备cDNA，扩增免疫球蛋白基因中的可变区并克隆到pFab5c载体、构建文库在噬菌体展示抗体的Fab（抗原结合片段），随后用表达特异性抗原的细胞反复筛选来纯化噬菌体颗粒，筛选的同时会用一个对照抗原来做一个去选择，因此想比杂交瘤技术噬菌体展示通常有着更高的阳性率来获得肽段特异、MHC限制的单克隆抗体。另外就是免疫这一步骤也可能省略：人体天然的外周血单核细胞（PBMC）噬菌体展示技术可以用来筛选TCR模拟单抗的筛选。传统的免疫和杂交瘤方法需要耗时数月却只得到很少的克隆，相反噬菌体展示方法可以在数周内制备阳性克隆；噬菌体展示的另一个优点就是可以获得全人源的单抗，省去了人源化小鼠的需求或是抗体人源化的步骤。
但是优于缺少体内的亲和力成熟步骤，TCR模拟抗体往往比从免疫和杂交瘤方法制备的抗体显示更低的结合亲和力（百纳摩尔级vs低位数纳摩尔级），因此很多噬菌体文库制备的TCR模拟抗体都需要经活体外的亲和力成熟，可以通过随机突变的方法来进行包括随机突变目标片段上的氨基酸或者Stewart-Jones在2009年报道的结构指导的突变方法：在报道的案例中，研究人员首先获得了2个Fab片段结合NY-ESO-1157-165/HLA-A*0201高分辨率晶体结构，随后和识别同一个pMHC复合物的TCR结构进行比较；基于比较的结果，研究人员评估了Fab中单个氨基酸在结合NY-ESO-1肽段的亲和力与特异性中的贡献，随后突变了那些可以通过优化侧链指导结合NY-ESO-1而不结合HLA的氨基酸，就通过这个方法将2个Fab的亲和力提升了20倍至2nM但是丝毫不影响结合的特异性，如果不这样，随机突方法在提升亲和力的同时却会降低特异性。
制备靶向新生抗原TCR模拟抗体要来得更加复杂，新生抗原的鉴定是一个限速步骤。随着NGS技术和生物信息学算法的不断进步，制备针对高度个体化的新生抗原的TCR模拟抗体的流程将会更加有效及时的进行，如下图所示：
随着靶点鉴定和抗体制备的发展，TCR模拟抗体一出炉就显示出上升的前景。在实验室和临床前研究中，研究人员在治疗癌症的开发中测试了TCR模拟抗体。这些抗体主要靶向两类抗原，即肿瘤相关的病毒抗原和肿瘤相关的自身抗原。尽管由于高度特异性，靶向新生抗原代表主流前沿，但是特异性的新生抗原的极度稀缺大大的限制了TCR模拟抗体治疗的应用。
肿瘤相关的病毒抗原是特异性表达在病毒感染的细胞的外来蛋白，像EBV病毒属于人疱疹病毒γ亚科，在90%的人类种群中发现。EBV与一些了人类肿瘤，如伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌相关。NUS的团队报道制备了靶向EBV病毒蛋白的三个全新TCR模拟抗体，(HLA)-A∗0201在细胞表面呈递了EBNA1562–570、LMP1125–133和LMP2A426–434这三个蛋白。该研究组用这些TCR模拟抗体来处理B淋巴母细胞株（BLCLs），结果显示在免疫缺陷小鼠中抑制了BLCLs，用TCR模拟抗体处理的小鼠显示了更长的生存。肝癌是另一个与病毒感染相关的恶性肿瘤，目前还没有针对肝癌的抗体治疗，虽然有像glypican-3这样的潜在靶点有一定的希望。尽管有研究报道过TCR模拟抗体可以有效治疗HBV阳性的肝癌，但是HBV抗原不仅在肿瘤细胞表达，也会在感染的肝脏细胞表达，因此不能忽视TCR模拟抗体治疗带来的严重肝损伤风险。
肿瘤相关的自身抗原是另一类TCR模拟抗体治疗癌症的潜在靶点。如前文所述可以通过免疫和杂交瘤法得到鼠源的TCR受体模拟抗体，照此制备的抗体被证明能抑制癌细胞：特异性结合PR1/HLA-A0201的鼠源TCR模拟单抗可以在体外抑制急性髓样白血病（AML）前体细胞的生长，而特异性靶向结合在HLA-A02上的hCGβ（humanchorionicgonadotropin-beta，人绒促性素β）的鼠源抗体可以在乳腺癌的原位移植模型中延缓肿瘤生长。后来研究人员对用PBMC噬菌体展示平台制备的全人源抗体在体外和体内的多个肿瘤模型中进行验证：转录因子WT1（Wilmstumor 1）蛋白在一系列肿瘤中都发现了过表达，被认为是免疫治疗的首选肿瘤靶点，其被加工成一个9个残基的肽段WT1126–134 RMFPNAPYL(RMF)并由HLA-A0201呈递。Sheinberg制备了一个能结合RMF/HLA-0201复合物的全人源IgG1单抗“ESK1”，显示能否按照HLA-A/WT1限制的方式来结合CD34+/CD33+的AML白血病细胞，但并不结合正常的CD33+PBMCs；后来Dao证明ESK1可以在移植人源肿瘤的NSG小鼠中引发显著的抗肿瘤效应，该研究组又将ESK1应用到双特异性T细胞连抗体（BiTE）和CAR-T细胞上，都显示了令人鼓舞的抗白血病效应。
早期的T细胞模拟抗体的临床安全研究主要集中在肿瘤抗原的已有特征并会结合如CAR-T和TCR-T在内的基于TCR的治疗研究上，例如靶向WT1的ESK1有望进入临床。和基于TCR的其它治疗类似，TCR模拟抗体在动物实验中也有诸多限制，比如MHC或肿瘤肽段表位可能不保守。
抗原的鉴定和TCR模拟抗体的开发是研究中的活跃领域，比如Ahmed开发了靶向LMP2A的双特异TCR模拟抗体来治疗EBV+恶性肿瘤。这些靶点由于转膜定位，传统抗体难以识别，噬菌体展示可以用来分离特异性识别被I型HLA呈递在细胞表面的靶点部分。该领域进展的另一个例子由CRUK抗体治疗项目（TheCancer Research UK Oxford Antibody TherapeuticsProgramme）的一个研究团队完成，他们开发了针对HLA-A*0201和来自肿瘤靶点p53的肽段复合物的TCR模拟抗体（http://commercial.cancerresearchuk.org/sites/default/files/TCR%20Mimic_May%202018.pdf）。由于大部分人类肿瘤中都有p53突变或者降解，因此这个研究满足了一个巨大的需求。目前最先进的靶点鉴定平台就是Immatics的XPREIDENT系统，能够鉴定出大量的肿瘤相关蛋白并加速T细胞受体治疗的开发。
TCR模拟抗体有望通过靶向细胞内抗原来治疗癌症，如下图所示，基于TCR模拟抗体的治疗有很多潜在的机制。但是TCR模拟抗体在患者中的治疗应用仍然面临诸多挑战。由于已知的单倍型中MHC组成不变，TCR模拟抗体的特异性就由结合的肽段决定。脱靶效应是影响TCR模拟抗体治疗的应用的主要问题，源自量方面：1）TCR模拟抗体靶向的TAA可能不会专门在肿瘤细胞表达，例如HER2除了在特定癌细胞病理性过表达外，在正常细胞中也有着生理性水平的表达；2）TCR模拟抗体只需要通过肽段上很短一段关键的氨基酸来结合pMHC复合物，因此其它表位只要含有这段对结合关键的氨基酸序列，脱靶结合的可能性就很高。当然潜在的拓跋肽段序列可能不会被正确加工及被MHC呈递到细胞表面。考虑这些因素，在将TCR模拟抗体推进到人体试验前需要一些列检测来保证消除潜在的脱靶效应。
另一个要考虑的因素就是靶向的pMHC复合物在细胞表面的密度。MHC呈递肽段是一个非常复杂的过程，使得预测一个给定的表位在细胞表面的表达变得非常有挑战。决定pMHC呈递的两个主要因素包括蛋白的表达水平和降解程度，更好的理解抗原的加工机制和后续的调控过程有助于合理的开发TCR模拟抗体疗法。另一方面，MHC-1复合物表达的下调或者缺失可能是肿瘤逃避免疫监控的主要机制。因此亟需恢复癌细胞上的MHC-1以增强包括TCR模拟抗体在内的免疫治疗，针对这类情况的处理方法包括：增强HLA表达、HLA或β-微球蛋白的基因治疗以及NK细胞清除MHC-I阴性细胞。
增强TCR模拟抗体的效价可以解决抗原表位在细胞表面密度低的问题。IgG的效应功能包括抗体依赖的细胞毒（ADCC）、抗体依赖的细胞吞噬（ADCP）和补体依赖的细胞毒（CDC）。ADCC和ADCP依赖于免疫细胞，包括NK细胞和巨噬细胞；CDC不需要免疫细胞的粗壮乃。增强ADCC和ADCP被广泛应用，许多治疗型抗体都以此来提升治疗效果。Veomtt报道了通过改变ESK1的Fc区域ASN297上修饰的糖型，产生了去岩藻糖化和末端己糖（甘露糖或葡萄糖）暴露的TCR修饰抗体形式ESKM，不管是体外还是动物模型中，都极大的增强了ADCC和治疗效果。
在抗体上融合一个小分子药物或者是TCR模拟抗体和其它治疗联合也可以增强效能。ADC药物已经在多种癌症中证明有效，有研究报道在靶向黑色素瘤抗原MART-126-35/A2或者gp100280-288/A2的TCR模拟抗体的Fab上偶联了假单胞杆菌的内毒素片段，能够明显抑制体内黑色素瘤移植物的进展。但是MHC复合物的内化程度很低，所以ADC的策略在大部分TCR模拟抗体上很难行得通。和其它药物的联合治疗也能提升疗效，前面提及的ESKM联合一系列TKI相比任何一种药物单独使用在小鼠模型中都能更强的抑制慢性髓系白血病（CML）。
构建双特异抗体或者BiTE是另一种增强TCR修饰抗体效能的方法。双特异的TCR模拟抗体可以同时靶向2个p-MHC分子，提高了获得疗效的机会。而BiTE抗体引起强大的T细胞的细胞毒作用在小鼠肿瘤模型中显示也是一种有效策略，还是前文提到的BiTE形式的TCR模拟抗体ESK-BiTE能够选择性的结合WT1/HLA-A*0201阳性的肿瘤细胞，在体外和体内对多类人肿瘤细胞显示出治疗活性。基于TCR模拟抗体的CAR-T细胞也能增强疗效，进一步拓展了TCR模拟抗体的应用。Rafiq和ZhangG分别在实验室构建了靶向自身抗原，如WT1和GP100的CAR；另一项研究中发现了新生抗原H3.3K27M能激活CD8+T细胞，并且可以被开发成基于T细胞的疗法的靶点，用来治疗扩散型内因性脑神经质瘤患者。
制备pMHC复合物的不同方法需要在未来进一步的优化，在抗体筛选中这些制备的pMHC复合物的构象可能和细胞表面呈递的不能完全匹配。评估并验证这些构象的研究结果会对进一步的开发治疗型TCR模拟抗体有帮助。
最后一点要考虑的就是，对于多种基于TCR模拟机制的治疗来说，细胞表面一定的抗原密度是必需的，如上图所示。因此TCR模拟机制治疗中抗原密度的必要性是另一个应该进一步研究的课题。
总之，尽管进入临床应用的进程受到诸多阻碍，但是由于自身独特的好特异性和高亲和力，TCR模拟抗体在癌症治疗的开发中是有着显著的潜力。
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