接触动物细胞转染已有三年，很少看到大家用最原始的方法提取质粒了，自己偷偷摸索出来的提取质粒的方法，也耐不住寂寞写写如何用最普通的碱裂解方法，提取到无内毒素、浓度高的细胞转染级别的质粒。
课题组经费一直紧张，导师没钱给买试剂盒，转染细胞用的质粒大多用的是小量提取的试剂盒提取的，浓度300-500ng/μL，每次30-50μL，对于熟悉做转染的同学知道，这根本不够用啊！怎么办？怎么办？怎么办？
只要思想不滑坡，办法总比困难多，查阅文献，书籍，让我摸索出来一套最经济实用的方法，不要着急，先看看提取的质粒纯度
再看看转染细胞以后的转染效率：（猪肾胚上皮细胞PK-15，转染效率一般实验室做最高70%也就不错了）
好了，废话不再多说了，直接把方法送给你们走上CNS的道路：
（1）从-20 ℃保存的甘油重组质粒菌液吸取50 µL菌液，接种5 mL的相应抗性液体培养基LB中，37 ℃振荡培养至OD600大于1.6~1.8，220 r/min，14 h。
（2）取上步2 mL的菌液于200 mL LB液体培养基中，37 ℃，220 r/min培养至OD600大于2.0以上，约16 h。
（3）取上步菌液，50 mL离心管，4 ℃，4000 r/min，离心15 min，收集菌体，200 mL平均收集到两个50 mL离心管中。
（4）弃上清，敞开管口，倒置，让上清全部流尽。（一定要清除干净）
（5）用预冷的40 mL STE充分悬浮菌体沉淀。
（6）4 ℃，6000 r/min，离心10 min。
（7）弃上清，敞开管口，倒置，让上清全部流尽。
（8）用预冷的6 mL Solution I充分悬浮菌体沉淀。
（9）加入新鲜配制的12 mL Solution II，上下颠倒数次，置于冰上10 min。
（10）加入预冷的溶液Ⅲ 7 mL，迅速上下颠倒充分混匀后，冰上放置10 min。
（11）4 ℃，8000 r/min，离心15 min。
（12）收集上清，加等体积的异丙醇，室温放置30 min。
（13）4 ℃，8000 r/min，离心10 min，如果有沉淀，取上清再次离心。
（14）弃上清，用30 mL 70 %乙醇洗涤沉淀两次，室温放置20 min，沉淀溶于3 mL TE中。
（15）加入3 mL预冷的5 moL/L的LiCl，混匀后，4 ℃，8000 r/min, 离心10 min。
（16）取上清至新的50 mL离心管中，加入等体积异丙醇，室温15 min，8000 r/min，离心15 min。
（17）在离心管中加入70 %乙醇20 mL，洗涤沉淀2次，室温晾干。
（18）每个50 mL离心管中，加入1 mL TE，转移至2 mL离心管中，加入浓度20 mg/mL RNase A 10 µL，室温放置30 min。
（19）加入等体积的酚：氯仿：异戊醇=25：24：1，混匀，4 ℃，12000 r/min，离心10 min。
（20）取上清转移至新的2 mL EP管，加入等体积氯仿，混匀，4 ℃，12000 r/min，离心10 min。
（21）取上清，加入两倍体积的无水乙醇，加入上清1/10体积4 M LiCl，-20℃放置60 min。
（22）4 ℃，12000 r/min，离心10 min。
（23）沉淀用1 mL 70%乙醇洗涤2次，室温晾干20 min。
（24）加入1 mL dd H2O 溶解。
（25）每个1.5 mL离心管中加入0.5 mL新配制的40 %PEG8000-MgCl2溶液，混匀，室温放置30 min。（一定要新鲜配制）
（26）室温，12000 r/min，离心20 min。
（27）加入1 mL 70 %乙醇，4 ℃，12000 r/min，离心5 min。重复此步。
（28）沉淀室温晾干20 min。
（29）加入TritonX-114使得在TE溶液中终浓度的为1%，冰浴10 min，然后42 ℃，10 min，室温，12000 r/min，离心5 min，吸取上清加入预冷的1.5 mL 离心管中。
（30）加入2倍体积的无水乙醇，加入上清1/10体积4 M LiCl，- 20 ℃下沉淀60 min。
（31）4 ℃，12000 r/min，离心10 min，弃上清，70 %乙醇洗沉淀3次，室温晾干，加入400 µL dd H2O溶解。将纯化后的质粒通过NanoDrop-1000测定浓度，用1%琼脂糖凝胶电泳，120 v，30 min，检测质粒纯度。
怎么样？如果有足够的经费当然是试剂盒，如果真的没有资金，您不妨试试我的方法，我们相信，贫穷永远限制不了我们的想象力。
你们等等，让我先去哭一下
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