哪怕是到了2018年，RNA-seq仍然可以不做重复

先申明，只是说可以，但是并不推荐这样做！！！

很多benchmark文章推荐做RNA-seq的时候，每个处理最好是做5个以上的重复，当然，研究者为了节约经费，通常只做3个重复，更有甚者做两个也行。但是只做一个，往往就麻烦了，因为没办法进行常规的统计学检验看处理前后的差异表达的显著性。

但是2018年二月的一篇文章，仍然是不做重复，文章是: Transcriptional Regulation of the Warburg Effect in Cancer by SIX1 

文章背景

这个转录因子 sine oculis homeobox 1 (SIX1) 在器官发育过程起着非常重要的作用，如下：

• Six1 knockout (KO) mouse embryos have defects in several organs

• Six1 KO mice die shortly after birth. SIX1 is overexpressed in many cancers

• Increased SIX1 expression predicts poor clinical outcomes.

• SIX1 can promote tumor growth and metastasis.

以前没有SIX1基因在cancer metabolism的研究，所以作者探究 它，如下：

To identify SIX1 downstream effectors, we performed RNA sequencing(RNA-seq) using SIX1 stable knockdown (KD) ZR75-1 breast cancer cell line or control cell line.

发现了1900个受SIX1基因调控的基因，这个转录组数据上传到了GEO，GSE93925 所以我看了看，赫然发现，居然只有两个样本。

但是作者对这1900个受SIX1基因调控的基因做KEGG富集分析，发现了 他想要的 glycolysis pathway被富集出来。

所以作者挑选感兴趣的基因看了看热图；

而且，更重要的是用了 Real-time RT-PCR confirmed the altered expression of known SIX1 target genes and 11 glycolysis-related genes 这样的实验验证。

而且作者的转录组数据分析结果与2009年的一个 MCF7 breast cancer cellsoverexpressing SIX1芯片数据比较了

虽然转录组测序只做了一个，但是实验环节，都是5个重复的。

Moreover, compared with SIX1 WT ZR75-1 cells, SIX1 KO cells generated by CRISPR/Cas9showed markedly reduced GLUT1, HK2, PFKL, ALDOA, GAPDH, PGK1, ENO1, PKM2, and LDHA, but not GPI and PGAM1, at the mRNA and protein levels

那么给大家留几个问题：

1. 转录组测序是测序深度重要还是生物学重复重要呢？比如，100M的reads测一个样本，还是选择测2个样本，每个样本是50M的reads呢？

2. 生物学重复是3个最佳吗？这个数字是咋来的呢？或者6更佳？