一篇文章,告我我们在生物样本提取之后,应该选择何种复溶溶剂来溶解提取物用于LC-MS分析。
生物体的代谢物包含了一系列不同生物化学性质,不同浓度的小分子,使得我们很难在分析中覆盖所有的代谢物。现在大量的研究已经从代谢物的提取方法,色谱分离,质谱分析等方面来考察何种方法可以帮助研究者提高检测中代谢物的覆盖面。但是,很少有研究对复溶溶剂进行优化,以达到检测更多化合物的目的。在样本提取物氮气吹干或者冻干之后,在进行LC-MS分析之前,需要首先对其复溶,但是几乎所有的非靶向代谢组学研究都未解释复溶溶剂如何选择。
据文献报道,很多非靶向代谢组学文章使用了不同的复溶溶剂,这里用水在有机溶(甲醇,乙腈,乙醇)剂中占的比例来表示,100%,95%,80%,70%,50%,33%,30%,30%,20%,和0%。所以本文作者就详细的考察了在样品复溶过程中,应该如何选择复溶溶剂。
文中所使用的样本为,溶菌酵母(LB),和人体血清样本。经过甲醇提取之后,考察了不同的复溶溶剂对化合物数量的影响。
Reconstitution in 100 % H2O results in the highestnumber of metabolite features detected in untargeted analyses
图a上,不同比例的甲醇/水作为复溶溶剂,随着甲醇比例的提高,检测到的化合物数量降低,除80-90%和90-100%甲醇外,其他有显著性差异。100%水检测到1491个化合物;100%甲醇检测到1099个化合物。
图a下,不同pH值对提取数量的影响。随着pH值的升高,化合物数量有小幅度降低。pH2.9 (1272),pH 10.5 (1213)。
图b上,不同的复溶溶剂表现出明显的变化。
图b下,不同的pH同样表现出了一定的变化趋势。
图c,对于不同的化合物,由于其溶解性不同,因此不同的复溶溶剂,以及不同的pH值都会对其响应以及峰形有很大影响。
Reconstitution in 100 % H2O increases the response ofmetabolites with logP <>
接下来的对比中,作者引入了logP(logarithm of their partition coefficients)值来研究化合物的极性是否和复溶溶剂有相关性,因为化合物的极性很大程度上影响了化合物的溶解性。(logP<5,亲水;logp>7,疏水)5,亲水;logp>
作者选用了十种具有不同logP值的化合物标准品加入到样本提取物中来考察复溶溶剂对它们的影响。
图a,复溶溶剂对它们的影响有的较为缓慢,有的则较为急剧。所有的logP值小于5的化合物中,除了山奈酚(kaempferol),其他化合物的溶解性均随着甲醇比例的升高而降低。
图b,ATP的信号强度,在甲醇比例增加到20%时就急剧下降。棕榈酸(palmitic acid)的信号强度在甲醇比例增加10%的情况下便会急剧下降。
Reconstitution in 100 % H2O covers a majority of thehuman blood metabolome
图c,柱状图展示在HMDB数据库中,记载的存在于人体血样中的化合物的预测logP值。化合物总数为4398个,其中74%的化合物的logP值小于5(亲水性)。疏水性的化合物(logP>7)占化合物总数的19%。
Reconstitution in 100 % H2O results in maximalmetabolome coverage in untargeted analyses
图a,实验流程,对比100%甲醇,50%甲醇(被认为可以综合提取亲脂性和亲水性化合物),100%水作为复溶溶剂对化合物数量的影响。
图b,50%甲醇对比100%水,有57%的化合物的foldchange<>(响应降低);5%的化合物fold change>1(响应提高);其他保持不变。
图c,50%甲醇对比100%甲醇,有28%的化合物响应提高,有61%的化合物响应强度没有变化。
结果表明,100%水和100甲醇复溶后,提取的化合有很大的重叠。加50%的甲醇到水中,会造成大部分化合物响应降低;而加50%的水到甲醇中,并未影响大多数化合的响应。100%的水的确会造成少部分疏水性化合物的响应降低,但是相比于提高了大多数亲水性化合物的响应,这个降低显得微不足道。另外,如果要研究疏水性化合物,可能需要选择更专属的提取方法,比如甲醇/氯仿提取等。
结论:
用100%水作为生物样本甲醇提取物的复溶溶剂,可以检测到更多的化合物,提高检测化合物的覆盖面。
个人观点:
在文章投稿时,也曾被问到为何选用某一种溶剂对化合物进行复溶,但是却未考虑系统的对此进行研究,只是简单回复审稿人参考了某某文章。
本文系统的考察了不同的复溶溶剂对检测化合物的影响,为研究者选择复溶溶剂提供帮助。
作者用logP值来对化合物的极性进行量化,通过检索HMDB获得了大部分在血液中存在的化合物的预测logP值,从理论上入手进行研究,值得学习。
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