土霉素，普罗帕酮和安乃近的抗肿瘤作用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及三种非临床抗肿瘤药物，被发现具有抗肿瘤作用，主要是能够显著抑制肺癌A549细胞或者子宫颈癌Hela细胞的增殖。要解决的技术问题：利用肺腺癌A549细胞和子宫颈癌Hela细胞筛选一些临床用药，以得到具有具有抗肿瘤作用的非临床抗肿瘤药物。解决该问题的技术方案的要点：应用饱和浓度的药物处理肺腺癌A549细胞和子宫颈癌Hela细胞48h，通过显微镜观察细胞形态和数量变化。对有抑制作用的药物，再进行细胞生存率和LDH活性检测，Hoechst33258检测细胞凋亡。主要用途：发现显著抑制肺癌A549细胞或者子宫颈癌Hela细胞增殖的非临床抗肿瘤药物，用于肺癌或者子宫颈癌患者的临床治疗。
【专利说明】土霉素，普罗帕酮和安乃近的抗肿瘤作用
【技术领域】
[0001]本发明涉及三种药物的抗肿瘤作用的新功能。具体地说，本发明涉及三种非临床抗肿瘤药物，被发现具有抗肿瘤作用，主要是能够显著抑制肺癌A549细胞或者子宫颈癌Hela细胞的增殖。
【背景技术】
[0002]临床试验是新药研制的最后一环，它需要花费巨资资金。老药新用，特别是发现经过长期临床实践应用的“老药”具有新用途的意义十分巨大，其价值绝不低于发现一种新药。目前几乎没有一种药物能达到完全治愈肺癌或者宫颈癌等癌症患者的功能，因此，寻找一种有效的、特异的、毒副作用小的新型抗肿瘤药物是至关重要的。
[0003]很多老药的新用途都是临床医生在临床实践中发现的，具有较大的偶然性。如果有意识，有计划地检测一些临床用药的新用途，就可能更快地，更多地发现它们的新用途，应用于临床，会缓解甚至解除患者的病痛，会产生很大的社会效益和经济效益。这是一种有效的和节俭的发现新药的途径。
[0004]土霉素(oxytetracycline),普罗帕酮(propafenone)和安乃近(metamizol ；dipyrone)等药物都是非临床抗肿瘤药物，利用肺腺癌A549细胞和子宫颈癌Hela细胞筛选这些临床用药，可能发现它们抗肿瘤作用的新用途。

【发明内容】

[0005]在本发明中在国际上首次发现土霉素，普罗帕酮和安乃近这些非临床抗肿瘤药物，具有抗肿瘤作用。具体说，土霉素，普罗帕酮和安乃近都能够显著抑制肺腺癌A549细胞的增殖，而只有普罗帕酮能够显 著抑制子宫颈癌Hela细胞的增殖。
[0006]土霉素，普罗帕酮和安乃近对肺癌A549细胞或者子宫颈癌Hela细胞生存率的抑制作用。使用浓度为0.005g/L至0.2g/L的土霉素，普罗帕酮或安乃近，分别处理肺癌A549细胞或者子宫颈癌Hela细胞48h，应用SRB方法检测细胞存活率，结果显示，普罗帕酮能够以浓度依赖的方式显著抑制子宫颈癌Hela细胞的生存率，而土霉素和安乃近抑制作用不显著(图1A)。这三种药物都能够以浓度依赖的方式显著抑制肺癌A549细胞的生存率(图1B)。通过测到的细胞生存率，计算半数生长抑制浓度(IC5tl),结果在表1中。
[0007]土霉素，普罗帕酮和安乃近对肺癌A549细胞或者子宫颈癌Hela细胞形态的影响。当使用浓度大于0.014g/L的普罗帕酮处理子宫颈癌Hela细胞48h后，应用倒置显微镜观察，与对照组相比，细胞数量明显减少，出现细胞变圆，破碎等现象。当使用浓度分别为0.1，
0.02，or 0.lg/L的土霉素，普罗帕酮和安乃近处理肺癌A549细胞48h后，与对照组相比，细胞数量明显减少，也出现细胞变圆，破碎等现象(图2)。
[0008]土霉素，普罗帕酮和安乃近对肺癌A549细胞或者子宫颈癌Hela细胞LDH活性的影响。分别使用浓度为0.lg/L，0.02g/L or 0.lg/L的土霉素，普罗帕酮和安乃近处理A549细胞或者Hela细胞48h，以浓度为0.1%的DMSO处理组作为对照组，检测各实验组以及对照组的LDH值。通过对各实验组与对照组的LDH值进行统计学分析比较，结果显示各组间无显著性差异，表明这些药物抑制这些肿瘤细胞的增殖，不是通过化学刺激等促进细胞坏死的途径发挥作用的(图3)。
[0009]土霉素，普罗帕酮和安乃近诱导肺癌A549细胞或者子宫颈癌Hela细胞的凋亡。当使用浓度为0.014g/L或者更高的普罗帕酮处理Hela细胞48h后，应用Hoechst 33258检测细胞凋亡。结果显示，普罗帕酮能够显著促进Hela细胞的凋亡(图4)。说明普罗帕酮主要是通过促进细胞凋亡，发挥抑制Hela细胞增殖的作用。当使用浓度为0.014g/L的普罗帕酮，或者浓度为0.lg/L 土霉素和安乃近处理A549细胞48h后，应用Hoechst 33258检测细胞凋亡。结果显示，土霉素和安乃近都能够显著促进A549细胞的凋亡，而普罗帕酮不能够显著促进A549细胞的凋亡。说明土霉素和安乃近主要是通过促进细胞凋亡，发挥抑制A549细胞增殖的作用，而普罗帕酮不是主要通过促进细胞凋亡，而是通过阻滞细胞周期等途径发挥抑制A549细胞增殖 的作用。
[0010]本发明使医疗界首次认识到，土霉素，普罗帕酮和安乃近，这三种药物都能够以浓度依赖的方式显著抑制肺癌A549细胞的增殖。普罗帕酮能够以浓度依赖的方式显著抑制子宫颈癌Hela细胞的增殖。
[0011]本发明的有益结果是，临床肺癌患者进行常规抗肿瘤药物治疗的同时，服用土霉素，普罗帕酮和安乃近，可以在一定程度上抑制肿瘤的进展，缓解患者的病情。临床子宫颈癌患者进行常规抗肿瘤药物治疗的同时，服用普罗帕酮所允许的最高剂量，可以在一定程度上抑制肿瘤的进展，缓解患者的病情。可能会产生很大的社会效益和经济效益。
[0012]本发明可能促使化学家对土霉素，普罗帕酮和安乃近结构进行改造，研制出更有效的抗肿瘤药物。
[0013]本发明会使更多的医疗卫生工作者认识到，有计划地检测一些临床用药的新用途，就可能更快地，更多地发现它们的新用途，这是一种有效的和节俭的发现新药的途径。
【专利附图】

【附图说明】
[0014]图1是药物对Hela细胞和A549细胞生存率的影响。A:应用土霉素(O)，普罗帕酮(P)，安乃近(M)或者0.1% DMSO处理Hela细胞48h。土霉素(ο)和安乃近(M)使用浓度为0.2g/L。普罗帕酮(P)使用从0.005g/L至0.02g/L的不同浓度。B:应用土霉素(0)，普罗帕酮(P)，安乃近(M)或者0.1% DMSO处理A549细胞48h。土霉素(ο)使用浓度分别为 0.15g/L，0.lg/L 或 0.05g/L ;普罗帕酮(p)浓度分别为 0.03g/L，0.02g/L 或 0.01g/L。安乃近(M)使用浓度分别为0.2，0.1或0.05g/L。SRB法检测细胞存活率(*p < 0.05，**p< 0.0I vs.对照)。
[0015]表1是土霉素，普罗帕酮和安乃近分别处理A549细胞或Hela细胞48h后半数生长抑制率(IC5tl)值(g/L)。
[0016]图2是药物处理48h对Hela细胞和A549细胞形态的影响(200倍)。a_e =Hela细胞:A549细胞。A和f是对照，细胞经过DMSO 0.1% (v/v)处理。b:土霉素的浓度为0.2g/L ；c:安乃近的浓度为0.2g/L ；d, e:普罗帕酮的浓度为0.012或0.014g/L。g和h:土霉素的浓度分别为0.1或0.15g/L。i和j:普罗帕酮和安乃近的浓度分别为0.02或
0.lg/L。[0017]图3是药物处理对Hela细胞和A549细胞LDH活性的影响。A:普罗帕酮(p)或
0.1 % DMSO处理Hela细胞48h。普罗帕酮(p)的使用浓度分别为0.012g/L或0.014g/L。B: 土霉素(O)，普罗帕酮(p)，安乃近(M)或0.1% DMSO处理A549细胞48h。土霉素(O)，普罗帕酮(P)，安乃近(M)的使用浓度分别为0.lg/L, 0.02g/L或0.lg/L。(实验重复3次)
[0018]图4是药物处理对Hela细胞和A549细胞凋亡的影响。A:细胞凋亡形态图；B和C:细胞凋亡比率。药物或者0.1 % DMSO处理细胞48h，利用Hoechst33258检测细胞凋亡。A:a-e =Hela细胞；f-j:A549细胞。a和f是对照。b:土霉素(ο)使用浓度为0.2g/L ；c:安乃近(M)使用浓度为0.2g/L ；d, e:普罗帕酮(P)使用浓度分别为0.012g/L或0.014g/Lo g和h:土霉素(ο)使用浓度分别为0.lg/L或0.15g/L。1:普罗帕酮(p)使用浓度分别为0.02g/L。j:安乃近(M)使用浓度为0.lg/L。B:与A部分中a_e对应的Hela细胞凋亡比率。C:与A部分中f，g，i和j对应的A549细胞凋亡比率。数据来源于3次不同的实验(*p < 0.05)。 【具体实施方式】
[0019]对临床肺癌患者进行常规抗肿瘤药物治疗的同时，服用土霉素，普罗帕酮和安乃近，可以在一定程度上抑制肿瘤的进展，缓解患者的病情。临床子宫颈癌患者进行常规抗肿瘤药物治疗的同时，服用普罗帕酮所允许的最高剂量，可以在一定程度上抑制肿瘤的进展，缓解患者的病情。
【权利要求】
1.一种发现非临床抗肿瘤药物的抗肿瘤作用的方法，主要是发现三种非临床抗肿瘤药物能够显著抑制肺癌A549细胞或者子宫颈癌Hela细胞的增殖。其特征在于利用肺腺癌A549细胞和子宫颈癌Hela细胞筛选一些临床用药，以得到具有具有抗肿瘤作用的非临床抗肿瘤药物。
2.根据权利要求1所述的内容，其特征在于三种非临床抗肿瘤药物是土霉素(oxytetracycline),普罗帕酮(propafenone)和安乃近(metamizol)。
3.根据权利要求1所述的内容，其特征在于土霉素，普罗帕酮和安乃近都能够显著抑制肺腺癌A549细胞的增殖；普罗帕酮能够显著抑制子宫颈癌Hela细胞的增殖。
4.根据权利要求1所述的内容，其特征在于利用显微镜观察肿瘤细胞形态和数量，初步筛选过具有抗肿瘤作用的临床药物。
5. 根据权利要求1所述的内容,其特征在于通过检测肿瘤细胞生存率和LDH活性的检测，以及H0echst33258检测细胞凋亡，分析所研究临床药物抗肿瘤作用的强弱和初步机制。
6.根据权利要求1所述的内容，其特征在于本方法利用肺腺癌A549细胞和子宫颈癌Hela细胞主动地筛选一些临床用药，而不是通过临床实践被动地发现老药的新用途。
【文档编号】A61K31/65GK103536607SQ201210251287
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年7月10日 优先权日:2012年7月10日
【发明者】邵金辉 申请人:邵金辉