噬菌体抗体库技术是制备重组抗体的主要方法之一。该技术可避免使用复杂的细胞杂交瘤技术，直接从基因水平制备特异性单链抗体，简便、快速，被认为是继杂交瘤技术后抗体生产技术的又一次革命。
噬菌体抗体是噬菌体表面表达有抗体分子Fab或单链抗体的单链噬菌体(或称纤丝状噬菌体，最常见的如M13)，这种表面表达是通过Fab或单链抗体与单链噬菌体外壳蛋白(PⅢ或PⅧ)形成融合蛋白而完成的。
通过多轮的抗原吸附-洗脱-扩增，最终筛选到的所需的噬菌体抗体。筛选到的噬菌体抗体克隆可应用琥珀突变子TAG及不能通读琥珀突变的受体菌获得可溶性的Fab 或ScFv。
Fab是其中一种功能性小分子抗体片段，包括重链VH-CH1(Fd段)和完整的轻链，两者通过一个链间二硫键连接，是完整抗体的三分之一。Fab 类抗体自身具有诸多优势， 相对分子质量小、 更容易获得、成本更低及可使用多种表达系统等， 且因为没有Fc 部分，不会产生抗体依赖性细胞介导的细胞毒或补体依赖性细胞毒性，这些促使 Fab 类抗体片段有着良好的发展前景。
Part 01
小鼠免疫
1、免疫动物的选择
Balb/c健康雌性小鼠，鼠龄6-8周，每组4-5只，除免疫组外，设置空白对照组。
2、实验材料
① 抗原，PBS调整蛋白抗原浓度为0.7mG/mL。
② 弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，无菌PBS。
③ 注射器，微量注射器，离心管等。
3、免疫程序的确定
参考以下流程，在三免后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价（用ELISA检测）。效价达到16000以上的小鼠进行最后一次冲击免疫，效价在16000以下的小鼠继续第四次免疫。
冲击免疫后第三天后取脾，准备提取RNA。
好的免疫效果：血清效价达16000以上，脾脏粘连，且大小是对照小鼠脾脏的2倍以上。
Part 02
从小鼠脾组织中提取总RNA
1、实验材料
① 新鲜的脾脏、RNase清洁剂（喷雾）、预冷平皿。
② RNA上样缓冲液：10%蔗糖，90%甲酰胺，0.05%溴酚蓝。
2、取脾，分离脾细胞
① 用70%乙醇或者RNase清洁剂（喷雾）处理所有实验用耗材和仪器，谨防RNase污染，处理后耗材低温放置。操作时争取在无菌环境下操作，带口罩、帽子、手套；
② 断颈处死免疫小鼠，用清洁的剪刀和镊子在超净工作台内打开小鼠的腹腔取其脾脏。将分离的脾脏组织放入平皿中，用剪刀镊子等去除筋膜。
③ 收集细胞：用10ml注射器吸取5ml PBS缓冲液，穿入脾脏中反复抽吸，将脾细胞冲出，将细胞悬液收集于15ml离心管中，于500g的条件下离心5min，收集细胞，弃上清。
④ 细胞计数：向细胞沉淀中加入 1mlPBS缓冲液，吹打重悬至单细胞状态，用细胞计数仪进行计数。
3、提取RNA
（经费允许情况下，建议选用商品化的组织RNA提取试剂盒，如：Omega，E.Z.N.A Total RNA kit I， Cat：R6834-01）
① 将脾细胞悬液在500g的条件下离心5min，弃上清。用700ulTRK裂解缓冲液重悬细胞沉淀，充分混匀，直至液体清亮。
② 充分裂解5-10分钟后，将细胞裂解产物转移到匀浆管中，10000×g离心2分钟，将收集管中的液体转移到1.5ml离心管中。
③ 加入等量70%乙醇溶液，充分混匀。
④ 将液体转移到HiBind RNA 硅化柱中，室温下10000×g离心1分钟，弃去收集管中废液，将硅化柱重新放入收集管中。
⑤ 加入500ul RNA洗脱液I，10000×g离心1分钟，弃去收集管中废液，将硅化柱重新放入收集管中。
⑥ 加入500ul RNA洗脱液II，10000×g离心1分钟，弃去收集管中废液，将硅化柱重新放入收集管中。
⑦ 重复上述⑥，弃去废液后，将硅化柱放入新的收集管中。
⑧ 10000g离心2分钟，将硅化柱放入一个新的1.5ml无RNase的离心管中。
⑨ 按照20ul/100mg原组织重量的DEPC水重悬RNA，在硅化柱中心滴加40-70ul的DEPC处理水，室温下放置2分钟，10000g离心1分钟，弃去硅化柱。为提高产量，可以将离心管中的RNA液再次滴加到硅化柱中，再次离心。
⑩ 提取的RNA短期内使用可4℃放置保存，长期保存可以放在-70℃；可以取一定体积的RNA进行电泳，初步观察产物大小和含量，Nanodrop仪测RNA含量。
Part 03
RT-PCR获得第一链cDNA
可用商品化试剂盒完成，如：Superscript Ⅲ First-strand synthesis system for RT-PCR Invitrogen，Cat. No. 18080-051
① 无RNase的PCR管中依次加入：适量RNA（1uG，体系不超过8uL），1uL随机六聚体引物（50ng/uL），1uL 10mM dNTP，充分混匀；65℃孵育5min，冰上放置1min；
② 在该PCR管中，继续依次加入2uL 10×反转录缓冲液，4uL 25mM 氯化镁，2uL 0.1M DTT，1uL RNaseOUT™ (40U/uL)，1uL SuperScript® Ⅲ RT (200U/μL)。冰上操作完成此步骤；
③ 25℃作用10分钟，然后50℃作用50分钟，85℃作用5分钟终止反应，冰上放置；
④ 短暂离心，在反应液体中加入1uL RNase H，37℃作用20min去除RNA。反应完成后可以直接用于下一步PCR实验，剩余cDNA样品置-80℃冰箱中保存。
Part 04
PCR扩增Fab抗体基因
抗体分子具有相似的结构，由两条相同的重链和两条相同的轻链组成。轻重链链内和链间分别借助二硫键相连接。轻链包括可变区和恒定区两部分，各占长度的50%。重链可变区和恒定区长度之比约为1：3，分4个部分，分别为VH，CH1，CH2，CH3。
Fab是一种功能性小分子抗体片段，包括重链VH-CH1(Fd段)和完整的轻链，两者通过一个链间二硫键连接，是完整抗体的三分之一。构建噬菌体Fab抗体库需要通过PCR技术将抗体的Fd区和轻链两段基因序列扩增出来，分别插入到噬菌粒中，构建一个混合的携带Fab基因的噬菌体基因库。
1、用于建库的噬菌粒载体：
如：pCOMB3，pCOMB3XSS，都可以用于构建Fab抗体库。
⑴ pCOMB3
噬菌体载体pCOMB3来源于美国Scripps研究所，是在噬菌体载体pBluescript的基础上改造而得，被广泛运用于天然噬菌体抗体库的构建和Fab段抗体的表达。噬菌体载体pCOMB3的构建是将抗体的Fd链（包括VH和CH1结构域）与噬菌体外壳蛋白Ⅲ（pⅢ）连接形成融合蛋白。Fd/pⅢ融合蛋白和轻链蛋白基因分别被置于Lac启动子/控制子的序列控制之下，翻译成蛋白后分别通过如pelB先导序列导入细菌的细胞膜间隙，重链Fd通过与pⅢ融合镶嵌在膜上，而轻链则独自分泌入膜间隙，重链和轻链在膜上组装成有活性的Fab抗体。
噬菌体载体pCOMB3仅含有噬菌体F1的原始复制区域，只有在加入辅助噬菌体的情况下才能复制和包装成完整的噬菌体病毒。当带有外源基因的pCOMB3噬菌粒DNA转化细菌后，在辅助噬菌体的感染拯救下，通过细胞内基因重组后形成重组的噬菌体，此时的噬菌体带有两种外壳蛋白Ⅲ的形式：一种是Fab/pⅢ融合蛋白形式；另一种形式是形成噬菌体天然的外壳蛋白Ⅲ。这种Fab/pⅢ融合蛋白可与抗原结合而被用于特异性筛选，而天然的pⅢ蛋白则保持噬菌体对细菌的感染性，使重组的噬菌体得以增殖。
噬菌体载体pCOMB3带有氨苄抗性基因，而辅助噬菌体，如VCSM13带有卡那霉素抗性基因，因此在氨苄和卡那霉素的药物作用下，只有带有pCOMB3的重组噬菌体才能增殖，从而起到了一个选择增生的效果。
⑵ pCOMB3XSS
载体pCOMB3XSS是在pCOMB3载体上进一步优化的噬菌粒，稳定性有所增加，并且添加了两个具有不同识别序列的SfiI 酶切位点，便于整段的Fab, scFv,多肽或者其他蛋白基因的插入，添加了6×His和HA标签便于纯化和检测。载体中有一个琥珀型终止密码子，不用再利用SpeI/NheI双酶切法去掉pⅢ蛋白基因。将噬菌粒转入非抑制型菌株，如HB2151中，该终止子可以被识别，在翻译过程中在gIII基因前提前终止，避免产生含pⅢ蛋白的融合蛋白。pCOMB3XSS 中的“SS” 代表两段无关的填充序列（stuffer），其中轻链插入位点SacI和XbaI之间的填充序列为1200bp，Fd段插入位点XhoI和SpeI之间的填充序列为300bp，这两段序列也可以利用两端的Sfi I直接切除掉。
2、引物设计
扩增鼠Fab抗体基因的引物主要根据抗体基因不同家族的可变区基因序列设计而成，用于扩增抗体重链Fd部分，轻链k链和λ链的全长基因。参考文献和资料，本整理版protocol提供两套引物供参考：
1. 引物序列来自【重组抗体】2005版，沈倍奋，陈志南，刘民培主编，P101。
⑴ 扩增Fd片段，长度约660bp。
Xho I：CTCGAG；Spe I：ACTAGT
⑵ 扩增轻链片段，长度约660bp。
Sac I：GAGCTC；Xba I：TCTAGA
2. 引物序列来自Antibody Phage Display：Methods and protocols. Philippa M.O’brien，Robert Aitken.P39-P40.
⑴ 扩增Fd片段，长度约660bp。
Xho I：CTCGAG；Spe I：ACTAGT
⑵ 扩增轻链片段，长度约660bp。
Sac I：GAGCTC；Xba I：TCTAGA
pCOMB3，pCOMB3XSS两种噬菌粒插入Fd基因和轻链基因的酶切位点一致，因此上述的两套引物在两个噬菌粒中都可以使用。
3、PCR扩增Fd及轻链基因
① PCR反应体系：3ul cDNA模板，对应的上游引物/下游引物各2ul（浓度为10uM），1×PCR缓冲液，4ul dNTP(各2.5mM)，DNA聚合酶 1ul，补水至50ul；
② 反应条件：94℃ 5min后进行三步骤循环（退火-变性-延伸），即94℃ 40s，
52℃ 40s，72℃ 40s，共35个循环，最后72℃延伸7min；
③ 取轻链/Fd段PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳，两者的PCR片段大小均约为660bp。
④ 回收纯化轻链/Fd段PCR产物，-20℃冻存，备用。
Part 05
轻链基因库的构建
获得纯化的抗体Fd片段和轻链LC（light chain）片段后，先后将轻重链基因插入到噬菌粒载体中。一般建库时可以先克隆轻链，因为重链在抗体的功能方面起着主要的作用，先克隆轻链后克隆重链有利于提高抗体库的多样性。
1、轻链抗体基因的克隆
① 利用Sac I/Xba I双酶切LC片段以及噬菌粒载体（如pCOMB3或者pCOMB3XSS），选择其他不同的噬菌粒载体，结合质粒图谱选择不同的酶切位点，在引物设计时，将Sac I/Xba I更换为相应的酶切位点即可；
② pCOMB3载体的Sac I/Xba I两酶切位点距离很近（16bp）,因此酶切后LC片段以及噬菌粒载体pCOMB3可以直接用PCR产物纯化试剂盒进行回收纯化，并定量。Sac I/Xba I两酶切位点距离较远的噬菌粒需要用电泳胶回收进行片段的分离纯化；
③ 酶切后载体取2-3ug，轻链片段取0.7-1ug，用T4 DNA连接酶进行两片段的连接，反应体系为50-100ul，16℃放置，连接过夜；
④ 将连接产物加入0.1倍体积的乙酸钠（3M，pH=5.2），充分混匀。加入2.5倍体积冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀；
如：100ul酶切产物 80ul水 20ul 3M醋酸钠 500ul无水乙醇
⑤ -70℃放置一个小时以上，4℃，12000rpm离心20min，小心移出上清液，吸去壁管上所有的液滴；
⑥ 加入800ul75%乙醇，4℃，12000rpm离心5分钟，小心移出上清液，尽量去除掉管壁上的液滴；
⑦ 超净台内吹干残留液体，加入45-60ul无菌水溶解DNA沉淀。
2、转化电转感受态细菌（可以用XL1-Blue，HST08，Top10等）
① 取3μl纯化后连接产物加入100ul解冻的电转感受态细菌中，小心混匀，45-60ul的连接产物需要15-20个电击杯完成电转。冰上放置10min，转到预冷的0.1cm的电击杯中，轻轻敲击电击杯确保感受态细菌位于杯子底部；
② 将电击杯外壁擦干，推入电转化仪，1800v电压下进行电击，向电击杯中迅速加入1ml的37℃预热的SOC培养基，轻轻吹匀细菌后，转移到高压灭菌的小三角瓶中，收集所有电击杯中的菌液，每个电击杯用1ml的SOC液反复洗两次，全部收集在三角瓶中后，37℃摇床150rpm培养1h；
③ 用预热的SOC培养基等比稀释菌液，稀释梯度为10^-1～-9， 100ul加到900ulSOC培养基中，10^-5～-9 稀释度各取500µL涂Amp 平板，放于37℃孵箱，过夜培养，次日查看转化结果，数菌落克隆数目，根据转化效率初步估算库容量。
④ 随机挑取20个单细菌克隆，接种到5ml 2-YT培养基中，37℃摇床220rpm过夜培养，提取噬菌粒进行酶切鉴定（Sac I/Xba I双酶切）判断LC片段是否正确插入，也可以进行测序，鉴定LC链有无插入到噬菌粒中，计算阳性重组率，重组率应该不低于80%。
3、轻链基因库的构建
第一种处理方案：
① 将电击后复苏1小时的菌液加SOC液放大到500ml培养基中（根据菌种和噬菌粒的不同，选择加入相应的抗生素），放于37℃摇床中，200rpm培养至OD=0.8左右。留下100ml菌液中继续在摇床中震荡培养，220rpm摇菌6-8个小时左右后，用大提质粒试剂盒进行质粒的提取，以质粒的形式冻存轻链基因库；
② 取出的400ml菌液，在4℃，4000rpm离心20分钟收菌，重悬于15ml的17%甘油冻存液中，分装在1.5ml离心管中，冻存，以菌液的形式冻存轻链基因库。
第二种处理方案：
① 将电击后的剩余菌液用SOC培养基5倍稀释，涂布在10个大的平板上（根据菌种和噬菌粒的不同，选择加入相应的抗生素），放于37℃孵箱，过夜培养，次日每个平板加入10mlSOC液体培养基，刮取平板上的菌落，从10个平板上收集的菌液合并一起，在4℃，4000rpm离心20分钟收菌，重悬于15ml的17%甘油冻存液中，分装在1.5ml离心管中，冻存，以菌液的形式冻存轻链基因库；
② 取一只冻存菌，加入到100mlSOC液体培养基中，在摇床中震荡培养，220rpm摇菌6-8个小时左右后，用大提质粒试剂盒进行质粒的提取，以质粒的形式冻存轻链基因库。
Part 06
Fab小分子抗体基因库的构建
获得纯化的抗体Fd片段和轻链LC（light chain）片段后，先后将轻重链基因插入到噬菌粒载体中。一般建库时可以先克隆轻链，因为重链在抗体的功能方面起着主要的作用，先克隆轻链后克隆重链有利于提高抗体库的多样性。以下操作是在已经完成的轻链库基础上进行。
1、Fd基因片段的克隆
① 利用Spe I/Xho I双酶切Fd片段以及已构建好的轻链库噬菌粒载体；
② 轻链库噬菌粒载体上如果Spe I/Xho I两酶切位点距离较远（>15bp），双酶切后的载体需要用电泳胶回收进行片段的分离纯化。双酶切处理后的Fd片段可以直接用PCR产物纯化试剂盒进行回收纯化，电泳后纯化则Fd片段特异性更好；
③ 酶切后载体取1.5-2ug，Fd片段取500-700ng，用T4 DNA连接酶进行两片段的连接，反应体系为50-100ul，16℃放置，连接过夜；
④ 将连接产物加入0.1倍体积的乙酸钠（3M，pH=5.2），充分混匀。加入2.5倍体积冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀；
如：100ul酶切产物 80ul水 20ul 3M醋酸钠 500ul无水乙醇
⑤ -70℃放置一个小时以上，4℃，12000rpm离心10min，小心移出上清液，吸去壁管上所有的液滴；
⑥ 加入800ul 75%乙醇，4℃，12000rpm离心5分钟，小心移出上清液，尽量去除掉管壁上的液滴；
⑦ 超净台内吹干残留液体，加入45-60ul无菌水溶解DNA沉淀。
2、转化电转感受态细菌（不限于TG1菌，可以用XL1-Blue，ER2738等）
① 取3μl纯化后连接产物加入100ul解冻的电转感受态细菌中(最好使用新鲜制备的电转感受态细菌)，小心混匀，45-60ul的连接产物需要15-20个电击杯完成电转。冰上放置10min，转到预冷的0.1cm的电击杯中，轻轻敲击电击杯确保感受态细菌位于杯子底部；
② 将电击杯外壁擦干，推入电转化仪，1800v电压下进行电击，向电击杯中迅速加入1ml的37℃预热的SOC培养基，轻轻吹匀细菌后，转移到高压灭菌的小三角瓶中，收集所有电击杯中的菌液，每个电击杯用1ml的SOC液反复洗两次，全部收集在三角瓶中后，37℃摇床150rpm培养1h；
③ 用预热的SOC培养基等比稀释菌液，稀释梯度为10^-1～-9， 100ul加到900ulSOC培养基中，10^-5～-9 稀释度各取200µL涂Amp 平板，放于37℃孵箱，过夜培养，次日查看转化结果，数菌落克隆数目，根据转化效率初步估算库容量。
④ 随机挑取20个单细菌克隆，接种到5ml 2-YT培养基中，37℃摇床220rpm过夜培养，提取噬菌粒进行酶切鉴定（Spe I/Xho I双酶切）判断Fd片段是否正确插入，也可以进行测序，鉴定Fd片段有无插入到噬菌粒中，计算阳性重组率，重组率应该不低于80%。
3、噬菌体Fab抗体库的构建
第一种处理方案：
① 将电击后复苏1小时的菌液加SOC放大到500ml培养基中（根据菌种和噬菌粒的不同，选择加入相应的抗生素），放于37℃摇床中，200rpm培养至OD=0.8左右。留下100ml菌液中继续在摇床中震荡培养，220rpm摇菌6-8个小时左右后，用大提质粒试剂盒进行质粒的提取，以质粒的形式冻存噬菌体Fab抗体库；
② 取出的400ml菌液，在4℃，4000rpm离心20分钟收菌，重悬于15ml的17%甘油冻存液中，分装在1.5ml离心管中，冻存，以菌液的形式冻存噬菌体Fab抗体库。
第二种处理方案：
① 将电击后的剩余菌液用SOC培养基5倍稀释，涂布在10个大的平板上（根据菌种和噬菌粒的不同，选择加入相应的抗生素），放于37℃孵箱，过夜培养，次日每个平板加入10mlSOC液体培养基，刮取平板上的菌落，从10个平板上收集的菌液合并一起，在4℃，4000rpm离心20分钟收菌，重悬于15ml的17%甘油冻存液中，按200-300ul菌液的量进行分装，冻存噬菌体Fab抗体库；
② 取一只冻存菌，加入到100mlSOC液体培养基中，在摇床中震荡培养，220rpm摇菌6-8个小时左右后，用大提质粒试剂盒进行质粒的提取，以质粒的形式冻存噬菌体Fab抗体库。
Part 07
噬菌体抗体库的呈现
① 取冻存的抗体库菌液一支，在200ml 2YT-GX(G：葡萄糖，终浓度为0.4％，X为噬菌粒带的抗性，如Cm或者Amp)培养基中，37℃培养至OD≈0.5；
② 按MOI=20的比例加入辅助噬菌体M13KO7，约10^12cfu，室温静置30min；
③ 37℃，150rpm继续培养1h，加入卡那霉素，终浓度50μg/ml，并加IPTG至终浓度为0.1mM；
④ 继续于30℃，200rpm培养过夜；
⑤ 收集菌液至100ml离心管中，4℃，10000rpm，离心15min；
⑥ 取上清，每400ml上清加100ml PEG/NaCl溶液，冰浴 1h，4℃放置，过夜沉淀效果更好；
⑦ 4℃，10000rpm离心30min，弃上清，倒置 2min，弃掉多余液体；
⑧ 分别加入8ml PBS和2ml PEG/NaCl 重悬沉淀，充分混匀，冰上放置 20min；
⑨ 4℃，10000rpm离心30min，弃上清，倒置 2min，弃掉多余液体；
⑩ 加入PBS重悬沉淀，4℃，10000g离心10min，取上清，弃细菌残渣；BSA和甘油在离心后加入；
4℃保存：将沉淀的噬菌体加入4.5mlPBS，0.5ml的10% BSA（用PBS配制），然后用0.45uM的滤器过滤，分装后4℃保存；
-70℃保存：将沉淀的噬菌体溶液加加入2.5mlPBS，1ml的10% BSA（用PBS配制），1.5ml甘油，分装后-70℃保存；
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文字整理 │ 黄帮主
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