上一回我们讲到甲基化检测报告的解读。下面我们讲讲如何解读荧光定量PCR报告的报告。本次先讲相对定量部分。
大家都知道荧光定量PCR(即qPCR)分为相对定量与绝对定量两种。区别见下表:
相对定量 | 绝对定量 | |
提取什么 | RNA | DNA |
对样品的要求 | 高 | 一般 |
是否需要内参基因 | 需要 | 可不需要 |
是否需要对照组 | 一般需要 | 可不需要 |
是否需要制备标准品/标准曲线 | 不需要 | 需要 |
结果 | 比值 | 单位重量或体积内含有多少个目的基因,一般表示为10的几次方个拷贝数 |
单位 | 无单位 | 有单位:拷贝数(Copies)/重量或体积 |
常见用途 | 病理,医学 | 环境微生物 |
相对定量
我们提供的相对定量实验报告包含下几部分:
“图片文件”文件夹中包含引物调试结果、PCR的扩增曲线和熔解曲线。
下图为引物调试结果。每个样品三个泳道,左为使用第一套引物的产物,中为使用备用引物,右为空白对照。(相关信息隐去)
下图为扩增曲线
下图为熔解曲线
以上三个图供判断本次PCR的条件是否异常。有经验的用户会根据曲线发现问题所在。
“文档”文件夹中包含结果数据的excel文件。
“原始数据”文件夹中包含qPCR的原始数据文件。用ABI 7500或7900的配套软件打开。为方便查看,此文件夹中的原始数据已转换为上述的excel文件。
“附录”文件提供实验条件、qPCR参数等。您想知道的操作步骤和参数都已在里面列好了。
Word文件“上海捷瑞生物荧光定量PCR服务报告书”即为最终结果展示。其中,我们提供原始的Ct值。见下表。
(Ct: 即Cycle Threshold的简写,意为“循环阈值”,是指扩增曲线出现拐点时所对应的循环数)
以及经换算后的最终结果值(RQ,即RelativeQuantification的简写,意为“相对定量”)。见下表。
上表18S为内参基因,表达量都设定为1(无单位)。通常还会将其中某一组设为对照组(本例中为第一行071),将这组目的基因表达量也设定为1,其他组与对照组作对比,比值即为最终表达量RQ值。
附:关于RQ值的计算
RQ值有个著名的公式
RQ = 2^(-∆∆Ct)
如果这个公式不好懂的话请看下面:
算法1:对于指定某个目的基因在第N天的表达量是第0天的多少倍(默认第0天的表达量为1,无单位),计算方法如下:
其中,Ef即为扩增效率(Efficiency)。在相对定量PCR中,默认样品与内参的扩增效率是一致的,所以上下两个Ef是相等的,可以约掉,实际计算中可不考虑。
算法2:对于在同一个时间点,检测基因B的表达量是基因A的多少倍,计算方法如下:
其中,公式中每个CT值都是3个孔的平均值。具体每孔的CT值可在文件夹“文档文件”中对应的excel表格中找到。一般在计算过程中先将3孔的CT值平均后再代入公式进行计算。
其他情况,如“同一基因在不同组织中的相对表达量情况”“同一基因在同一组织中经不同处理方法后的相对表达量情况”等等,算法类似。总之最终都可以用2^(-∆∆Ct)这种方式来表示。
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