16S rDNA是细菌分类学研究中最常用的“分子钟”，总长约 1540 bp，其中包含9个可变区（Variable region）和10个保守区（Constant region）。可变区因菌种不同而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。通过检测16S rDNA可变区的序列变异和丰度，可了解环境样品中群落多样性信息，在微生物分类鉴定、微生态研究等方面起着重要的作用。
以Illumina为代表的二代测序技术，成本低，更适合大规模测序；但是受测序长度的限制，往往只能选择 1-3 个可变区作为扩增片段（目前常用扩增子片段是V4区），分类的准确性和一致性存在问题。
今天的主角是PacBio全长16S rDNA测序。利用该平台的长度长优势，可以获得16S全长序列，不仅能提高物种鉴定的分辨率，还能提高样本中微生物组成鉴定的精确度，从而能更加真实的还原样本中微生物的群落结构。今天就来扒一扒它和2代其他平台16S rDNA测序相比主要有哪些优势，以及全长16S rDNA测序还有哪些不完美之处。
全长16S产品优势
高通量--能同时分析群落中所有的微生物
高数据质量--采用PacBio的CCS模式，对序列自我矫正，数据一致性准确率高
高分辨率--分析16S rDNA全长，分类精准到种。
下面就以一篇2018年发表在Microbiome上的全长16S研究为例来进行说明：
样本：1.20种已知细菌的模拟菌群（BEI）
2.282种已知细菌的模拟菌群（CAMI）
3.12个健康人鼻窦区6个不同位置的微生物群
测序：PacBio RSII（FL16S） Illumina (16S v3-v5区)
分析：① 通过模拟菌群样本1和2来验证测序方法的准确性和精确性；② 样本3健康人鼻窦区菌群的全长16S基因测序分析。
研究结果
01 模拟菌群验证FL16S测序
通过对样本1模拟菌群进行全长16S测序和v3-v5测序，比较发现全长16s测序在种水平的置信度远高于v3-v5的种水平；样本2中227个OUT能够映射到CAMI模拟菌落中，具有95%种水平上的匹配度，验证了全长16S的准确性。
02 健康人鼻窦区菌群分析
基于样本1的和样本2的分析结果，利用SMRT测序分析样本3的未知菌种，从12个健康人鼻窦区不同位置的菌群结构聚类热图看，大部分的测序OUT都能够聚类到种水平。在环境样本中，短读⻓测序数据在复杂群类区分中失去优势，⽽FL16S则能在种⽔平上对菌群进⾏区分。
综上所述，PacBio全⻓16S rDNA测序可提供更准确的物种分类和更多的物种鉴定，在系统发育、群落鉴定和代谢通路预测⽅⾯具有更高的优势。
在和特定区域16S rDNA测序的PK中，PacBio全长16S rDNA完胜！不过全长16S rDNA测序仍还有不完美之处：
① 不同物种的16S拷贝数存在差异，全长16S测序仍无法解决拷贝数不一致导致的丰度差异；
② 全长16S序列的获取仍需通过PCR过程，无法完全避免PCR偏好性带来的系统误差。
以上两点是目前16S rDNA测序固有的问题，如果对此非常介意的话，小编良心推荐您选择宏基因组学测序。
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