文章题目：Clinical Implications of Genomic Discoveries in Lung Cancer
研究人员：Charles Swanton, M.D., Ph.D. , and Ramaswamy Govindan, M.D.
发表时间：2016.05
期刊名称：The New England Journal of Medicine
影响因子：72.405研究背景
肺癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，近90%的肺癌由吸烟导致。主要的肺癌类型包括：腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞神经内分泌癌和肺类肿瘤。尽管不同组织亚型的肺癌会携带一些相同的变异，但大部分基因组变异还是截然不同的。在本综述中，我们探讨了近年来与腺癌、鳞状细胞癌和小细胞癌相关的基因组学分析以及它们在治疗方面的应用。
1. 基因组改变
基因组景观
与吸烟相关的肺癌是少数几个有高突变负荷的癌症之一。在肺腺癌中，相较于非吸烟者，吸烟者更容易发生C->A的颠换。吸烟者肺部恶性组织样本的全外显子测序表明，不考虑组织学亚型，在100万个碱基对中平均存在8-10个体细胞突变。在非吸烟的腺癌患者的样本中，100万个碱基对中大概有0.8-1个突变，突变率要明显要低很多。大量的体细胞拷贝数变异和基因重排进一步说明了肺癌基因组的复杂性。如此高的突变负荷，对试图发现新的低频变异的研究人员带来了特殊的挑战，需要大量样品（约3000）来得到一个完善的候选肿瘤基因集，以涵盖吸烟者的肺癌患者中突变频率大于2%的基因。
染色体变异和基因拷贝数变异
肺癌患者肿瘤样本的拷贝数分析确定了不同亚型之间常见的一些变异和特定亚型肿瘤中的变异。比如，3号染色体的短臂上有一些抑癌基因，经常在肺癌发展早期发生缺失，它们在肺癌的各种亚型中都有发生。在肺癌患者中比较常见的缺失基因座为CDKN2A。包含种系特异性致癌基因的染色体扩增区域通常具有组织特异性，比如在鳞状细胞癌和小细胞癌中位于3号染色体的长臂上的SOX2, 在腺癌中位于14号染色体的长臂上的NKX2-1。在肺癌患者中，已经报道了大量的体细胞拷贝数变异，包括致癌基因的扩增和肿瘤抑制基因的缺失，如Table1所示。
Table1. 肺腺癌，鳞状细胞癌和小细胞癌的复发性分子改变
DNA单核苷酸改变、插入和缺失
二代测序使得单碱基的检测具有较好的精确度。来自TCGA及其他机构的研究人员报道了许多肺腺癌、鳞状细胞癌和小细胞癌的基因组变异，如Table 1所示。在肺腺癌中最常见的突变致癌基因有：KRAS (33%)，EGFR (14%)，BRAF (10%)，PIK3CA (7%)和MET (7%)。涉及抑癌基因的突变有：TP53 (46%)，TK11 (17%)，EAP (17%)，NF1 (11%)，RB1(4%)和CDKN2A (4%)。约10%的肺腺癌携带染色质修饰基因(SETD2, ARID1A, SMARCA4)和RNA剪接基因(RBM10、U2AF1)中的突变。TCGA的数据表明：在颠换率低的组，相较于其他突变，EGFR突变更为常见（在无吸烟史的人群中富集）；在颠换率高的组，TP53、KRAS、NF1、STK11和RBM10突变更为常见（在有吸烟史或目前在吸烟的人群中富集）。
尽管在肺腺癌和鳞状细胞癌中存在一些共有的突变，如TP53和CDKN2A，然而鳞状细胞癌的特征在于低频的编码受体络氨酸激酶基因突变（RTK）和高频的抑癌基因缺失，如 PTEN、NOTCH1、 RB1。CDKN2A通常发生纯合缺失（29%），其次是甲基化（21%），失活突变（18%），跳过1β外显子的剪接变异（4%）。
小细胞肺癌的特征在于一些基因的复发性失活突变：RB1、RBL1、RBL2、TP53和PTEN；RNA调控基因（XRN1）；编码G蛋白伴随受体信号分子的RGS7和FPR1基因；具有中心体调控功能的ASPM、ALMS1、PDE4DIP。在一项关于小细胞肺癌体细胞变异的研究中，对110个肿瘤样本进行全基因测序，结果表明在13%的样本中TP73的突变和重排导致了致癌基因被激活，1/4的样本存在NOTCH家族基因失活突变。
表观遗传改变
通过表观修饰，与肺癌相关的几种抑癌基因被沉默。肺腺癌中已经报道了染色质修饰基因（SMARCA4,ARID1A, SETD2）中存在突变。一种肺腺癌亚型富集了SETD2突变和CDKN2A甲基化，被鉴定为CpG岛高甲基化表型。在小细胞肺癌中，CREBBP和 EP300的突变影响了组蛋白乙酰转移酶活性，甲基化转移酶基因MLL中也存在突变。
转录组变异
肿瘤标本的转录组分析得到了一些重要的发现，包括：DNA序列改变对转录本的影响，剪接位点突变和基因融合。U2AF1基因调控3′剪接位点的选择。3%的肺腺癌患者的U2AF1基因存在突变，它与许多基因的不适当剪接选择相关。在肺腺癌中，剪接位点突变会导致MET癌基因跳过重要的区域并造成稳定蛋白的持续激活。在肺腺癌中，涉及ALK，ROS，NTRK1，NRG1，FGFR4，ERBB4，BRAF和RET的融合事件和基因重排为治疗干预提供了机会。肺鳞状细胞癌的FGFR基因家族存在基因重排的现象已经被报道，它有可能会被作为治疗干预的对象。然而，在小细胞肺癌中报道的多数重排，包括转录因子、组蛋白修饰物、抑癌基因等目前还不能轻易的进行靶向治疗。
通路变异
综合分析全外数据和转录组数据发现，RTK–RAS–RAF通路的各种成分在肺腺癌中几乎总是受到影响（76%）。磷酸化蛋白质组学研究表明，在一些KRAS野生型肿瘤中，MAPK通路存在大量激活，这可能是因为RTK–RAS–RAF通路中存在尚未被发现的成员。影响肺腺癌的其他通路包括：细胞周期调节（64%），p53 (63%)，染色质和RNA剪接因子(49%)，以及氧化应激反应（22%）(Fig1)。
Fig1. 肺癌中的主要通路改变
由于拷贝数的变化，在鳞状细胞癌中与氧化应激反应和鳞状细胞分化通路相关的基因受到了影响。近1/3的鳞状细胞癌肿瘤样本中存在NFE2L2或KEAP1突变。这两种基因在细胞中对氧化损伤的反应中起重要作用，这可能是由与吸烟相关的细胞损伤造成的持续攻击引起的。
细胞起源
气道上皮细胞由多种细胞组成，异质性非常高。不同位置的细胞类型及比例都各不相同。在近端气道中，基底细胞、棒状细胞、纤毛细胞、神经内分泌细胞和杯状细胞占主要部分，肺泡由I型和II型肺细胞组成。肺癌的最终组织学类型取决于原始细胞的特定分子特征、导致这些细胞里分化通路失调的变异以及该过程发生的细胞环境(Fig.2)。基于小鼠模型的研究表明，气道神经内分泌细胞中TP53和RB1的缺失会造成小细胞肺癌。II型肺泡细胞、连接细胞和肺泡管中的棒状细胞被证明是小鼠肺腺癌细胞的起源。II型肺泡细胞在I型和II型肺细胞的更新中起作用，该过程可以通过死亡的I型细胞诱导产生，并依赖于表皮生长因子受体(EGFR), RAS和转化生长因子β (TGF-β)的信号转导。尽管缺乏确凿的功能证据，但是近端气道的基底细胞被假定为鳞状细胞癌的起源细胞。基于小鼠的研究可以进行谱系追踪，但这在人类中是无法进行的。对肿瘤发生过程中不同阶段肿瘤起始细胞进行全面的分子分析，将大大提高我们对肿瘤发生和发展的分子过程的理解。
Fig2. 不同组织亚型肺癌的细胞起源及特征变异
2. 克隆进化和内在异质性
实体肿瘤的基因组分析揭示了越来越多的分支进化证据，由多个不同亚克隆组成的肿瘤拥有共同的祖先，但在肿瘤进化的后期会发生一些变异。这样的亚克隆可能混合在一个肿瘤样品中，也可能在原发性肿瘤中区域隔离，这些亚克隆为肿瘤的适应性、选择性和进化适应提供了基础。
研究人员应用多区域、全外显子测序对11个早期肺腺癌患者的样本进行了测序 [1]。在每一个案例中，都发现了瘤内异质性和分支进化的证据。在21个与疾病相关的已知突变中，其中20个存在于每一个区域，表明对早期非小细胞肺癌中的单次取样方法足以描绘这种疾病的驱动事件。作者还研究了肿瘤中亚克隆的数量和复发之间的联系，发现在手术后21个月内发生复发的患者，其亚克隆突变的比例高于没有复发的患者。然而我们还需要更多的前瞻性研究来证实这些结果。De Bruin和他的同事们通过多区域外显子测序的方法研究了7个非小细胞肺癌，其中有5个肿瘤处于II期到IIIB期 [2]。在多个样品里检测到体细胞突变、拷贝数异质性、基因组扩增事件发生在肿瘤进化早期，且这些事件出现在每个肿瘤区域的所有亚克隆，这些事件就是肿瘤进化树的主干部分（Fig.3）。只在某一个区域出现的突变为分支事件，这些突变的中位数比例为30%。对晚期肿瘤只进行单样品分析时，有42%的概率会漏掉一些驱动突变。这些数据表明，单位点取样漏掉驱动事件的风险可能随着肿瘤的分期而增加。然而，我们还需要更多的研究去检验这一假设，例如英国TRACERx计划等。
Fig 3. 肺腺癌进化轨迹
在肺腺癌中，与未戒烟的肿瘤患者相比，已戒烟的患者基因组发生C->A颠换的比例有所减少，表明某些突变过程在肿瘤进化后期贡献主要致癌作用，削弱吸烟的致癌作用。与观测结果一致，亚克隆突变在TpC位点富集了C->T和 C->G突变，这是APOBEC胞嘧啶脱氨酶蛋白家族的突变过程的特征。抗病毒酶APOBEC家族提供了重要的天然免疫防御，并且能让病毒DNA或RNA产生突变，使其不能复制。APOBEC3B是癌症的一个主要诱变源。在APOBEC的背景下，驱动基因上发生的突变通常属于亚克隆突变，促进了肿瘤的多样性和分支进化——该发现与APOBEC突变过程的重要性一致。也有证据表明，细胞毒性药物如铂类药物用于治疗非小细胞肺癌，也许也会留下亚克隆突变的足迹。随着基因组测序数量的增加，发现基因组内新的环境和内源性突变过程的能力将增加，从而揭示驱动突变累积和分支进化的突变过程。
小鼠研究也揭示了肿瘤内异质性驱动的小细胞肺癌扩散转移的复杂性，以及原发癌－多克隆－转移癌，和转移定殖的亚克隆基础。在极少的情况下，由EGFR突变引起肺腺癌在转化为小细胞肺癌的过程中，伴随着抑癌基因RB1的丢失。
3. 治疗意义
确定治疗的靶标分子
携带EGFR变异的肺腺癌的治疗已经取得了重大的进展。与铂类药物化疗相比，携带EGFR激活突变的转移癌患者在使用了特异性EGFR激酶抑制剂后，会有显著更高的反应率和无恶化生存期。肿瘤细胞发生ALK重排的转移性非小细胞肺癌患者使用ALK抑制剂后也有类似的结果。特异性激酶抑制剂也被用于包括ROS1、RET和BRAF分子靶标的研究中。肺癌突变联盟已经报道了携带明确定义分子改变的患者在使用分子靶向治疗后，相较于肿瘤组织中没有这样靶标的患者，有更好的治疗效果。这也突出了识别肿瘤细胞中致病变异的重要性。目前，基于一些癌症基因的二代测序正在越来越多的用于临床。在国家癌症研究所资助的一个大型研究Lung-MAP中，研究人员正在通过使用基于二代测序技术的多基因芯片来探索靶向治疗对鳞状细胞癌患者的可用性。在英国进行的National Lung Matrix Trial 也涵盖了非小细胞癌患者中靶向治疗应用，该实验根据个体或遗传标志物组合划分了21个组。
肺癌克隆进化的意义
肺腺癌和其它实体瘤的研究表明，在治疗过程中，某些新出现或者已有的亚克隆具有进化选择优势，使肿瘤细胞更适应药物选择压力。中性进化也可能发生在非小细胞肺癌中，它会进一步增加选择作用的底物的多态性。大量的肺癌相关的基因组学研究使用的样本是从还没有接受过任何系统性治疗的患者中采集的。获取疾病发展过程中样本是非常重要的，这有助于在系统治疗后全面了解克隆进化。随着测序和肿瘤取样方法的改善，研究人员正在记录肺腺癌靶向治疗的多种抗药机制。这些数据表明，未来药物发展策略中应考虑克隆进化和肿瘤内异质性的体细胞事件。
免疫治疗反应的预测
研究人员正在努力确定针对晚期非小细胞癌中PD1受体的药物反应的生物标志。Rizvi及其同事表明，抗PD1治疗的反应与吸烟特征及非同义突变负荷有关。此外，肿瘤消退与CD8+ T细胞的新抗原特异性反应相关，这表明基于肿瘤的基因组特征进行选择性和针对性的免疫治疗是有潜力的。
循环肿瘤标志物的潜在用途
通过液体活检技术获取的ctDNA可以用于检测早期和晚期癌症里的体细胞变异及拷贝数变异。可切除的非小细胞肺癌患者的血浆中cfDNA浓度高于健康人或慢性呼吸道炎症患者。该技术可用于跟踪随着时间推移的肿瘤基因组进化，还能检测靶向用药位点及监控有抗性的亚克隆，避免了多次活检取样。循环肿瘤细胞在小鼠中的研究为新药物的开发提供了一定的支持，尤其是在小细胞肺癌中，肿瘤材料的获得通常受到限制。
4. 未来研究方向
近5年的研究已经揭示了肺癌发生的早期体细胞事件。随着测序方法敏感度的不断提高，通过cfDNA分析检测早期肺腺癌和鳞状细胞癌的能力得到提升，该技术可以作为放射学筛查的补充方法。我们在识别生物标志物方面已经取得了重大进展，但是在预测患者术后是否复发方面还比较欠缺。此外，我们对晚期疾病的转移过程和生物学特征知之甚少，应加强对尸体解剖的研究，以进一步了解晚期癌症转移过程。有证据表明，肿瘤发展的亚克隆与癌转移的亚克隆之间的相互依赖关系可能会产生新的治疗方法。
与生态演化类似，癌症的进化是一个受限制的过程，其进程可能受到宿主基因组、肿瘤进化的前期步骤以及肿瘤的微环境的影响。更深入的理解肺癌进化的空间和时间动态可能会产生新的治疗方法，以阻止肿瘤的进化。应对这些挑战时，需要充分了解肺癌在术后的时间、空间上，及在面临环境、药物及免疫选择的压力下的进化。许多研究正在努力解决这些问题，例如在TRACERx的研究中，研究人员正在利用不同空间和时间节点肿瘤取样的方法，以提升他们对循环生物标志物的理解。
随着深度测序变得越来越普遍，在临床护理中，信息学和临床基因组数据分析的进展非常重要，这些进展必须提供实时反馈：在患者和医生负担得起的前提下，将最新的、可用的基因组学研究成果应用于临床。基因组研究中使用的知情同意书应向患者介绍与基因组检测相关的风险，包括隐私的泄露，及试验可能会偶然检测出与某些可能发生的特定疾病相关的种系有害突变。与基因组研究相关的知情同意书应给予患者是否愿意被告知偶然发现的选择权。
另外，关于治疗方法的研究仍然任重道远。比如，制定靶向KRAS突变的策略时，应当首先研究肺腺癌中最常见的驱动致癌基因。制定利用协同致死的治疗策略的是一个研究热点：某两种或更多的基因产物的破坏可导致细胞死亡，但单独抑制其中任何一种都是无效的。协同致死的概念往往与相对棘手的治疗靶点（如KRAS）相关。随着我们对肺癌遗传依赖关系的了解程度的提升，肺癌的缺陷可能暗示着新的治疗途径。
非小细胞肺癌（包括鳞状细胞癌和腺癌）的突变负荷可能是免疫治疗的阿喀琉斯之踵。在决策治疗方案的顺序时，可能需要考虑诱变疗法的医源性影响，因为一些有细胞毒性的化疗和放疗可能会造成新的突变，这也会对免疫疗法的作用产生影响。此外，目前预测肿瘤新抗原发展的方法仍不成熟，仅限于MHC I类。对MHC I类和II类限制性新抗原的理解的提升可以帮助我们更好的了解肿瘤进化过程中的免疫监视。最后，理解疾病发展过程中免疫微环境影响癌症基因的方式，及在多样化的基因组景观背景下，宿主免疫系统对肿瘤新抗原的反应方式，可能提供一个改善肺癌患者生存结果的方向。
参考文献：
[1] Zhang J, Fujimoto J, Zhang J, et al. Intra- tumorheterogeneity in localized lung ad- enocarcinomas delineated by multiregionsequencing. Science 2014;346:256-9.
[2] de Bruin EC, McGranahan N, Mitter R, et al. Spatial andtemporal diversity in genomic instability processes defines lung cancerevolution. Science 2014;346:251-6.
[3] Charles Swanton, Ramaswamy Govindan. Clinical Implications of Genomic Discoveries in Lung Cancer[J].N Engl J Med, 2016,374:1864-1873.
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