本文对前列腺肿瘤以及相邻的正常细胞进行了RNA测序分析，以鉴定在这些细胞中已经表达的多态性STR。
文章题目：A microsatellite repeat in PCA3 long non-codingRNA is associated with prostate cancer risk and aggressiveness
研究人员：澳大利亚前列腺癌研究中心，澳大利亚卫生与生物医学创新研究所等多个研究机构
发表时间：2017.12.4
期刊名称：Scientific Reports
影响因子：4.259文中对前列腺肿瘤以及相邻的正常细胞进行了RNA测序分析，以鉴定在这些细胞中已经表达的多态性STR。临床样本中大多数表达的STR位于内含子和基因间区。研究分析结果表明，与邻近的正常细胞相比，有三个STR（TAAA-ACTG2, TTTTG-TRIB1和 TG-PCA3）在前列腺癌中具有多态性和表达差异。在前列腺癌细胞中，抗雄性激素药物恩杂鲁胺（enzalutamide）可以抑制TG-PCA3 STR表达。前列腺癌患者和健康对照组（N>2000）的遗传分析显示TG-PCA3 STR最常见的11个等位基因与前列腺癌显著相关（OR = 1.49; 95% CI1.11–1.99; P = 0.008）。侵袭性疾病 (OR = 2.00; 95% CI1.06–3.76; P = 0.031)和高死亡率（HR = 3.0; 95% CI 1.03–8.77;P = 0.045）之间也具有显著相关性。文中提出，TG-PCA3 STR对前列腺癌具有诊断和预后潜力。文中也提供了概念验证，可以用于其他RNA测序数据集，以在未来的临床探索研究中确定与疾病相关的STR。
研究背景
短串联重复序列（STR）是基因组中2-6个核苷酸多态性延伸的重复序列。DNA复制时的滑链现象会导致STR收缩或扩张进而形成STR多态性 。在人的基因组中，STR具有高多态性，并且分布广泛，这些特征使得STR在家系和法医科学中被广泛用作遗传标记。此外，也有证据表明，基因上STR的扩增会引发疾病，最近的研究也表明了STR与基因表达的相关性。例如，关于STR造成疾病的首次报道称雄性激素受体AR基因第一个外显子上CAG的扩增导致了脊髓型肌肉萎缩症。之后的研究表明，STR的扩增与40余种孟德尔疾病相关，很多这样的疾病已经被收录在公共数据库中。值得注意的是，CAG STR常见于调节蛋白中，这些基因上CAG重复的扩增会影响蛋白功能。有趣的是，已有报道表明，由STR编码的重复蛋白序列是导致聚谷氨酰胺疾病（如：亨廷顿舞蹈症）的重要因素。
作为疾病的调节者，STR越来越受到人们的关注。近年来，科研工作者们在通过高通量测序表征人类基因组STR方面做出了一致努力。但STR的多态性在前列腺癌中扮演的角色尚不清楚，许多研究聚焦于AR 1号外显子上的CAG和GGN重复。比如，早期遗传关联性研究的meta分析表明，AR上CAG和GGN重复次数越少，前列腺癌风险越高。实际上，功能性启动子报告基因测定表明，CAG收缩引起的更短的AR增加了AR激活基因的能力。
使用单核苷酸多态性（SNP）的全基因组关联分析（GWAS）已经在人类基因组中鉴定出约100个前列腺癌风险区域。尽管GWAS取得了进展，但SNP仅占家族性前列腺癌的约33%。这表明大部分（约67%）的遗传性前列腺癌风险存在于其他的变异中。此研究结合STR的上述特征，着重于用STR来解释前列腺癌的一些“失踪遗传”。
研究方法
前列腺癌患者和健康对照组
前列腺癌患者1,153例，收集他们的年龄、家族史、种族、用于提取DNA的血液样本、病理报告和病例记录等信息。正常对照组共1,210个参与者，所有参与人员都要完成一份关于详细的问卷调查，包括年龄、家族患癌史，以及其他的一些和健康相关的信息，包括BMI和吸烟史。大部分病例和对照样本都是欧洲背景。所有的方法都是按照相关指导原则和规定进行的，所有的实验方案都得到了澳大利亚昆士兰科技大学人类伦理委员会、澳大利亚红十字会服务部门和昆士兰癌症委员会的批准。所有的患者都提供了明确同意参与该项研究的书面材料。
人类基因组中STR的表征
详细的分析流程如图1所示。STR是从RepeatMasker库(hg19.fa.out, Repeat Library2012012436)中的Simple_repeats类别中定义的。使用自定义的perl脚本表征RepeatMasker库中STR的数量、长度以及GC含量。RepeatMasker库中的多态性STR是通过使用Perl筛选lobSTR预测的千人项目数据集(1000Genomes_Phase_1.vcf.gz38)的STR得到的。基本上，如果染色体坐标重叠，并且如果基序（包括反向和反向互补的基序）匹配，lobSTR就可以在RepeatMasker库中鉴定出（非）多态STR。这可以过滤掉只在一个程序中预测到的STR。
图1 a.识别前列腺癌中表达的STR的生物信息分析流程 b. RepeatMasker中鉴定STR的算法。例子中，X染色体上，如果两个数据集之间STR的基因组坐标重叠并且序列匹配，它们就被认为是相同的STR。否则，它们不被认为是相同的STR（交叉）。
前列腺癌细胞系的雄激素和抗雄激素治疗
RNA分离和RNA测序
从RNA测序数据中确定STR等位基因和STR的表达
使用lobSTR 分析来自LNCaP前列腺癌RNAseq数据集，8个临床前列腺癌RNAseq数据集以及含有14种临床前列腺癌和它们相对应的正常细胞的RNAseq数据集（Ren等人）的STR的表达数据。lobSTR可以识别和量化如RNAseq数据集的高通量数据中的STR表达。该程序以毛细管电泳（黄金标准）为基准，识别的STR至少有89.5%的一致性。使用RNAseqFASTQ文件的默认参数进行lobSTR分析。STRreads的数量是从‘ALLREADS’格式的字段确定的，reads的数量相对于总的比对上的RNAseq读数进行标准化以确定FPKM值。分析过程中排除了少于10个reads的STR等位基因。
含有候选STR的基因的差异表达分析
在临床样本中，使用t检验和log2中位数的强度值对差异表达的含有候选STR的8个基因的转录组分析进行评估，使用的数据集有Ren等人的含有14个前列腺癌样本及其匹配的相邻正常细胞的数据集、Talor等人含有29个正常样本和131个前列腺癌的数据集。在分析RNA数据时，使用Tophat将RNAseq比对到hg19上，使用edgeR确定差异表达基因。
RT-qPCR验证
DNA提取和STR基因分型
统计分析
年龄值以平均值±标准差（mean ± SD）表示。年龄值的统计分析通过不成对的t检验进行(GraphPad Prism 7.00)。BMI和年龄使用非参数、不成对的t检验进行分析。对于患病组和对照组的其它参数，如吸烟、喝酒和婚姻状况，它们的频率使用成对的、非参数t检验进行统计分析。对于只有两对值可用的参数，如输精管切除手术和家族史，使用双向ANOVA检验。使用置信水平为0,05的卡方检验来确定STR是否在Hardy-Weinberg平衡内。为了分析前列腺癌风险和疾病侵袭性，使用单变量二元逻辑回归（IBM SPSS Statistics; 23.0）分析TG-PCA3 STR的相关性，其中因变量是病例-对照组状态或Gleason评分类别。P<>组：GS <8 =侵袭性较小，gs="" ≥8="侵袭性疾病。对于所有的基因型关联分析，最常见的纯合11/11基因型被用作参考。使用bootstrapping分析（IBM" spss="" statistics="" 23.0）进行随机抽样和替换测试，1000个样本的种子值使用1,000,000次。除非另有说明，统计分析中只考虑了pca3="" str的11/11,="" 11/12和12/12基因型，剩下的基因型由于频率低而不在分析中。使用graphpad="" prism="" 7.00的log-rank="" (mantel-cox)测试进行生存分析，并绘图。根据tg-pca3="" str基因分型选择了28例患者肿瘤组织及其相邻正常细胞的rna进行与pca3="" mrna水平rt-qpcr相关pca3="" str基因分型。使用非参数kolmogorov-smirnov检验确定基因型-表达的相关性，并使用graphpad="" prism="">
研究成果
人类基因组中的STR具有多态性并分布广泛
分析评估人类基因组中STR的发生，以确定其是否具有作为前列腺癌风险遗传标记的潜力。图2a显示，人的基因组中共有413,414个STR（在RepeatMasker库中的简单重复序列），STR是第五常见的重复基序。
图2 人基因组中STR的表征(a) Repeat Masker库中人的413,414 STRs (Simple_repeats, 黑条)重复单元数量的直方图(b)直方图显示基因组中二碱基重复最多，六碱基重复最少 (c)散点图表明基因组中大多数的STR含有较少的G和C核苷酸（重复单元的GC%）(d)饼状图表明2-6碱基STR，共223,742（58%）具有少于5%的突变、插入或缺失。（e）饼状图表明RepeatMasker库中223,742个STR中的121,835个（75%）在Willems等人的千人基因组数据集中检测出来。Willems等人研究得到的STR中，120,806个 (99%) 是多态的。
最常见的四种重复DNA序列来自LINEs和SINEs。LINEs和SINEs中的SNP已经在GWAS中研究了。因此，STR代表了遗传流行病学研究中尚未被充分研究的另一种遗传变异的储库。大多数STR是二碱基重复（图1b）。值得注意的是，GC含量高于50%的STR较少（图1c）。这表明人的基因组选择不含有G和C核苷酸的STR，基因上STR的组成可能潜在影响生命机理。
由于目前使用的毛细管分离的片段分析平台不能准确识别STR等位基因中的单核苷酸差异，下面的分析中将不分析单碱基重复。这样在后续分析中就排除了26,872个STR（6.5%，如图1d）。由于本研究聚焦于研究STR扩增而不是序列转换对前列腺癌的影响，超过5%突变、删除、插入的STR在后续也不进行分析。这就过滤掉了162,800个（42%）STR，后面将使用223,742个STR（58%）进行分析（图1d）。
接下来分析223,742个STR中哪些具有多态性。因此，这些STR针对Willems等人的（非）-多态性STRs数据集进行了筛选，这些数据集是之前在第一阶段基于千人基因组数据分析得到的。使用Perl脚本，在Willems数据集中检测出121,835个（75%）STR，其中120,806 个STRs (99%)具有多态性（图1e）。使用脚本鉴定RepeatMasker数据集和 Willems数据集中共有的STR，以确保该研究中的STR具有高置信度。这种保守的筛选过程为后续的分析提供了一个假定的多态性STR列表，以在前列腺癌RNAseq数据集中进行查询时使用。
STR在前列腺癌细胞中容易表达。
图3 RNAseq数据集中STR的表达情况 (a) 二，三，四，五，六碱基重复STR表达的气泡图。大的气泡表明表达量越高。深色的强度气泡表明具有特定长度和重复单元的多个STR表达了。(b)饼图详细描述了LNCaP细胞系、Ren等人的临床前列腺癌RNAseq数据集以及8个临床前列腺样本中表达的STR位于基因间区、启动子、5'UTR，编码区（CDS），内含子或3'UTRDNA的比例。
图3a和图4显示了用雄激素（DHT）或治疗性抗雄激素（比卡鲁胺，恩扎鲁胺）治疗的LNCaP前列腺癌细胞系、临床前列腺癌细胞以及它们相应的相邻正常细胞系中STR表达的气泡图。
较大的圆圈表示与其它STR（小圆圈）相比，具有特定的STR高度表达。图3a表明，转录本不倾向选择重复数量高的较长的STR，这一点对于2-6个重复的STR是一致的。值得注意的是，五核苷酸和六核苷酸重复组成的STR具有相对高的表达，并且在LNCaP细胞系和临床样本的基因组中STR表达的位置不同。比如，在LNCaP细胞中表达的STR大多数位于3′UTRs 和编码DNA，然而临床样本中表达的STR主要位于内含子和基因间区段（图3b和表1）。
图4 在LNCaP细胞系(a)、Ren等人的临床前列腺癌RNAseq数据集(b)以及8个临床前列腺样本(c)中二，三，四，五，六碱基重复STR表达与STR长度（Y轴）和重复次数（X轴）相关性的气泡图。每种分析中的RNAseq样本数在数据集名字下方标明。
表1 RNAseq数据集中表达的STR在基因组位置上的分布
图5 肿瘤和相邻非癌细胞之间差异STR表达的散点图。（a）黑点突出的是8个候选STR，它们在RNAseq数据集，和/或在临床RNAseq 数据集（n=8）以及Ren等临床前列腺样本（n=14）中一直差异表达 (b) 8个候选STR在另一个临床前列腺癌样品队列（n=7）中的RT-qPCR分析。(c) Taylor等人非癌细胞（N）以及Gleason评分为6-9（G6，G7，G8和G9）的前列腺癌的微阵列表达数据分析。水平线表示每个组的平均表达水平。
在前列腺肿瘤和相邻的肺癌细胞中STR差异表达
为了候选等级的确认，基于STR是否频繁表达、是否在前列腺癌和相邻的非癌细胞中差异表达，对RNAseq分析的STR划分优先顺序。因此，开发了一种度量，它由每种STR的STR表达（肿瘤+非肿瘤）的差异倍数乘以特定STR表达的样本数之和组成。这使得能够检测在肿瘤中始终差异表达的STR，和/或易于在多个肿瘤中表达的STR。根据排好序的列表，选择了4个最高表达（在肿瘤中上调）的STR和2个最低表达（在肿瘤中下调）的STR进行后续的分析（图5a）。
另外七个临床前列腺肿瘤及其临近的正常前列腺细胞的RT-qPCR分析证实，相较于临近的正常前列腺细胞，肿瘤细胞中的TAAA-ACTG2（5/7病例），GAAA-PTGIS（5/7病例）一致下调（表达中的差异倍数> 2），另外，TTTTG-TRIB1 (7/7 例), TTTTTG-PRUNE2 (5/7 例), TG-PCA3 (5/7 例)一致下调（表达中的差异倍数> 2）（图5b和表2）。
表2 八个候选STR的总结。aRepeatMasker坐标（hg19）。bRT-qPCR验证了七个肿瘤中至少四个肿瘤的表达超过2-差异倍数。c表示（抗）-雄激素相应的下调。STR的位置，它们在肿瘤和（抗）-雄激素LNCaP细胞的表达以及预测的重复次数
值得注意的是，除了TTTTTG-PRUNE2，edgeR分析表明这8个STR与它们所在的基因具有相似的表达谱。使用Taylor等人的微阵列研究进一步检查候选的8个STR基因的差异表达，结果证实了之前的观测结果：TRIB1，PCA3和GRHL2在前列腺癌中过度表达，ACTG2，GSN和MXI1在前列腺癌中下调（图5c）。该分析显示PTGIS没有明显的表达差异（P=0.36），但是它在前列腺癌细胞中相较于相邻正常细胞是低表达的。
STR受雄激素和/或治疗性抗雄激素调节
鉴于AR信号通路在前列腺癌发展过程中非常重要，对雄激素和抗雄激素调节的5个候选的STR进行RT-qPCR分析。这5个STR中，只有TAAA-ACTG2在LNCaP前列腺癌细胞中没有表达（表2）。表达分析研究揭示了TTTTG-TRIB1和CAAAA-MXI1因为雄激素（DHT）而下调，而TG-PCA3 和CAAAA-MXI1因为LNCaP细胞中的治疗性抗雄激素，恩杂鲁胺（ENZ）而下调（图6，表2）。通过原型雄激素调节KLK3基因的表达以确保细胞被正确处理。
图6 LNCaP前列腺癌细胞中（抗）-雄激素调控的STR。分别用乙醇（Mock），10μM抗雄激素（比卡鲁胺（BIC），恩杂鲁胺（ENZ））或10nM雄激素（DHT）处理LNCaP细胞24小时。6个独立RNA的数据表示为SEM。*表示与Mock处理的细胞的显着表达差异（P <>
TG-PCA3与前列腺癌风险有关
对40名前列腺癌男性的分析表明，TG-GSN不能准确地进行基因分型，并且TTTTTG-PRUNE2和GAAA-PTGIS不是多态的。5个候选的多态STR都符合Hardy-Weinberg平衡，杂合度指数在0.05-0.575之间。
PCA3是一种新兴的前列腺癌生物标志物，在本研究中PCA3基因的TG STR表达受到抗雄激素治疗的调控，研究人员选择了TG-PCA3 STR在前列腺癌患者和对照组的大型队列中进行遗传关联分析。表3显示了该研究中样本集的一些社会统计学和临床的特征。患者和对照组的BMI等因素无显著差异。然而，两组之间的平均年龄有显著差异（P<0.0001）。共有68个患者发生全因死亡(all-cause>
TG-PCA3STR共有5个重复次数在9-13次的等位基因。最常见的TG-PCA3 STR是重复11次的等位基因，它与前列腺癌风险显著相关。相较于对照组（71%），前列腺癌患者含有11次重复的等位基因的频率较高（76%）（表4）。重复11次的TG-PCA3 STR等位基因与增加的前列腺癌风险显著相关（OR = 1.49; 95%CI 1.11–1.99; P = 0.008），而TG-PCA3 12重复等位基因与降低的前列腺癌风险相关（OR = 0.74; 95% CI 0.63–0.86; P < 0.0001）。基因型分析中，11/11基因型被用作参考标准，杂合子11/12="" (or="0.80;" 95%="" ci0.67–0.95;="" p="0.01)和纯合子12/12(OR" =="" 0.61;="" 95%="" ci0.44–0.83;="" p="">
表3 QLD研究人群的社会人口学特征和临床特征。a阳性家族史被定义为至少一个一级亲属患前列腺癌。b数据没有被收集用于回顾性研究。*（％）相对于整个队列。有“unknown”特征的个体不在分析之中。cP值来自非参数t检验。d双因素ANOVA检验
表4 TG-PCA3 STR的基因型和等位基因与前列腺癌风险的关联分析。计算使用a二进制逻辑回归，bage校正二进制逻辑回归，cbootstrap（双尾），dbootstrap（双尾）年龄校正,e家族史校正二进制逻辑回归,f bootstrap（双尾）家族史校正。11/11重复被用作基因型分析的参考（IBM SPSS Statistic Processor; 23）。 GS：Gleason得分；ns：不显著;CI：置信区间
TG-PCA3与前列腺癌侵袭性有关
结合患者Gleason评分，分析TG-PCA3 STR与前列腺癌侵袭性的关系。TG-PCA3 11重复的等位基因在Gleason得分≥8的患者中出现频率更高(OR = 2.00; 95% CI 1.06– 3.76; P = 0.031)（表5）。在于年龄校正相关的分析中也得到了相似的结果（OR = 2.33; 95% CI 1.16–4.67; P = 0.017，表5），表明11重复的TG-PCA3 STR与侵袭性相关且与年龄无关。Bootstrapping和年龄校正Bootstrapping分析证实了观察到的显著差异（表5）。
生存分析显示，12/12基因型的患者死亡率显著低于11/12（HR = 0.31; 95% CI 0.11–0.91; P = 0.032）以及11/11（HR = 0.33; 95% CI 0.11–0.97; P = 0.048）基因型患者（图7a）。TG-PCA3基因型和前列腺癌特异性死亡之间没有显著差异（图7b）。
表5 TG-PCA3 STR的基因型和等位基因与Gleason评分的关联分析。计算使用a二进制逻辑回归，bage校正二进制逻辑回归，cbootstrap（双尾），dbootstrap（双尾）年龄校正,e家族史校正二进制逻辑回归,fbootstrap（双尾）家族史校正。11/11重复被用作基因型分析的参考（IBM SPSS Statistic Processor; 23）。 GS：Gleason得分；ns：不显著;CI：置信区间
图7 11和12重复TG-PCA3基因型的患者死亡率数据。(a)总体死亡率（n = 845; * p = 0.045; * p = 0.032）。（b）前列腺癌特异性死亡率（n = 802）。肿瘤（T）和邻近的非肿瘤（NT）组织的2-ΔCt分析。（c）基因型表达 (λP = 0.0031; ɣP = 0.0013)和(d),等位基因表达分析 (#P = 0.0496).用Kaplan-Meier (Log-rank(Mantel-Cox)) (a,b); 和Kolmogorov-Smirnov (c,d) 检验计算P值。
TG-PCA3 STR基因型与PCA3 mRNA水平相关
相较于11/12和12/12基因型，PCA3的平均表达水平在11/11 TG-PCA3 STR中略高（图7c），但是并没有达到统计学意义。与具有12重复的等位基因相比，具有11重复的等位基因的肿瘤中PCA3显著更高（P = 0.049,图7d），表明TG-PCA3 STR可能在前列腺癌细胞中调控PCA3的表达。在11/11（P = 0.0322）和11/12（P = 0.0013）基因型患者中，PCA3的过表达显著高于相邻的非肿瘤组织（图7c）。在12/12基因型的患者中没有达到显著，这很可能是因为这一基因型的样品数太少。
讨论
STR是第五常见的遗传变异，研究人员保守估计120,806个STR可能可以通过准确的基因分型进行风险关联研究。文中揭示了人类基因组选择了某些特定的STR（GC含量低的二碱基重复），这也支持很多STR确实有相关功能这一观点，因为保守型是功能的度量。值得注意的是，Willems等人最近对人类基因组中所有STR的多态性进行了分类。作者从Willems等人的研究中收集并使用了这些数据，以鉴定在前列腺癌细胞中易于表达的多态STR。STR的扩增会对超过40种疾病产生影响，因此作者认为，基因中STR的扩增对前列腺癌的进展非常重要，可能会进一步减弱或加强进展。
全基因关联分析方法涉及筛选基因组中与前列腺癌风险相关的SNP，然后追踪风险的精确定位，并对因果SNP(causal SNP)进行功能验证。该研究中，作者提出了一种替代方法，由于STR高通量分型的成本和时间限制，在进行大规模病例对照组研究之前，首先鉴定推定的功能性STR。在研究的第一步首先聚焦于位于潜在重要前列腺癌基因的STR，这些基因包括：通过选择前列腺癌细胞与邻近正常前列腺细胞差异表达的基因，以及由雄激素和/或治疗性抗雄激素调节的基因，这些由激素调节的基因可能会通知参与治疗抗性的前列腺癌基因。
与之前的观察结果一致的是，人类基因组中选择了特定的STR类型，文中的RNAseq分析揭示了在前列腺癌细胞中也选择规避了表达特定STR的基因，特别是重复次数比较高的长STR。RNAseq分析也揭示了具有五碱基和六碱基重复的基因相对于具有四碱基、三碱基和二碱基STR的基因表达更高。有趣的是，研究发现在LNCaP前列腺癌细胞中表达的STR主要存在于3'UTR和编码序列中，而在临床前列腺样品中表达的STR主要位于内含子和基因间区。近来一项研究表明，去势难治性前列腺癌细胞（CRPC）表达很高的内含子DNA，这可能是由于全局转录增加引起的低效/失调的剪接造成的。因此，在作者和Ren等人的临床样本中内含子中STR的比例较高可能反映了这一假设。重要的事，内含子中STR扩增可能会通过形成二级DNA结构和形成有毒的RNA/DNA杂合体来影响生物功能。然而，目前尚不清楚为什么在基因间区域STR表达的比例较高，而在前列腺癌样品的基因上STR的表达比例较低。有可能这些差异是制备RNAseq文库造成的，Ren等人的研究在RT中使用poly-A选择的RNA和随机六聚体，而LNCaP RNAseq使用的是核糖体RNA耗尽的RNA和poly-A引物，8个临床样本使用了核糖体RNA耗尽的RNA和随机六聚体引物。尽管如此，这些差异表达的STR的任何生物作用都可能是以非蛋白质编码能力介导的。
使用新的度量标准，文中鉴定了前列腺癌RNAseq数据集中的8个STR，与邻近的非癌细胞相比，它们最容易和/或最一致差异表达。这8个候选STR中的6个(TRIB1, PCA3, GRHL2, ACTG2, GSN, and MXI1)，可以通过比较前列腺癌与相邻的非恶性肿瘤细胞的大量数据集来确定含有这些STR的基因的差异表达。除了TG-PCA3 STR之外，其他7个STR都不位于与前列腺癌强烈相关的基因上，这也强调了它的新颖性。因为AR信号通路和治疗靶向在前列腺癌中非常重要，作者还评估了这五个候选多态STR的雄激素和抗雄激素调控。值得注意的是，在LNCaP细胞中仅表达了GAAA-GRHL2，TTTTG-TRIB1，TG-PCA3和CAAAA-MXI1，并且TTTTG-TRIB1，TG-PCA3和CAAAA-MXI1受雄激素和/或治疗性抗雄激素调节。因此，总体而言，作者提出TTTTG-TRIB1和TG-PCA3是优先用于大规模病例对照研究的优异遗传标记，因为它们（i）与邻近的正常细胞相比，在前列腺肿瘤中一直差异表达，（ii）多态性，并且（iii）在由（抗）-雄激素调节的基因内（表2）。
作为概念证明，研究过程中在大型病例-对照队列中分析了PCA3STR,并发现它与前列腺癌风险，Gleason评分和全因死亡显著相关。PCA3是一种长非编码RNA（lncRNA），作为前列腺尿液生物标记物获得了广泛的关注，它可以补充目前的PSA血液检验。然而，这种lncRNA在前列腺癌中的作用以及作用机制仍不清楚。近来一项研究显示了一种方法，通过该方法在异种移植模型中PCA3可以增加前列腺细胞的增殖和前列腺癌细胞的生长。PCA3 lncRNA与前列腺癌细胞系（LNCaP和PC3）中的PRUNE2前体mRNA结合，产生双链RNA分子，因此在mRNA和蛋白水平均调节PRUNE2的表达。
研究中通过对前列腺癌患者和对照组的大型队列分析发现，TG-PCA3 STR 11个重复的等位基因与前列腺癌风险显著相关。
对患者按Gleason评分分组时，TG-PCA3 STR等位基因频率出现显著差异。TG-PCA3 STR 11重复的等位基因在Gleason评分≥8的患者中出现的频率较高。此外，相比于12/12纯合子患者，携带至少一个风险等位基因拷贝的患者在总生存分析中的预后显著较差。但是，没有发现与前列腺癌特异性死亡显著的关联。这可能是因为该分析队列中前列腺癌特异性死亡的事件数量有限。更大队列中的生存分析证实了该研究中观察到的趋势，即TG-PCA3 STR 11重复等位基因与更低的生存相关。
在11/11和11/12 TG-PCA3基因型的患者中，与邻近的非肿瘤组织相比，在肿瘤中观察到PCA3的显著过度表达。TG-PCA3 STR等位基因与PCA3表达相关，其中与具有12个重复等位基因的肿瘤相比，在具有11个重复的等位基因的肿瘤中观察到显著的高表达。这些结果表明，TG-PCA3 STR11重复的等位基因与前列腺癌高风险相关的机制之一是通过调控PCA3的表达。microRNAs结合3′UTR种子区域调控mRNA，TG-PCA3 STR可以通过修饰3′UTR种子区域(seed region)调控PCA3的表达。事实上，和较短的种子区域相比，较长的种子区域是进化保守的，表明它们被进化选择，因为它们在mRNA调控中更有效。随后，文中推测与12重复等位基因相比，较短的11重复等位基因与前列腺癌风险和PCA3的高表达相关联，原因也许是因为其潜在miRNAs结合的种子区域较弱。
最近发现，PCA3启动子中的TAAA STR与中国男性的前列腺癌风险相关。确定这种STR是否与TG-PCA3 STR有协同相互作用或是否处于连锁不平衡中将会非常有趣，这反过来又是导致前列腺癌风险增加的原因。也有一种可能，PCA3中的STR也可以简单的替代其他的已知的风险等位基因。然而，文中的表达相关性分析表明了TG-PCA3 STR的功能角色。
该研究的缺陷之一是临床上对照组尚未检测到前列腺癌患者的污染。不幸的是，对照组长期的随访超出了目前的研究范围。然而，根据年龄和家族史进行调整的单因素logistic回归分析也导致了STR基因型与前列腺风险相关联的风险估计值与最初的未调整分析结果类似。
在目前的研究中，研究人员不是在一个较小的样本集的两个阶段的病例对照设计中进行研究，而是在一个大样本集中进行meta分析，以提供有力的风险估计。文中通过bootstrap分析弥补了复制研究。虽然在一个独立和更大的队列进行遗传关联研究是必要的，但是该研究是目前前列腺癌STR样本量最大的研究。总体而言，未来的遗传流行病学研究可以采用类似的方法进行其它疾病与STR相关的研究。
参考文献：
[1]John Lai, Leire Moya, Jiyuan An, et7.
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