本研究通过对肝癌进行多点取样，进行外显子测序，从中挑选1200多个高质量的突变位点设计目标区域测序芯片，然后对肝癌组织和ctDNA进行全外显子和目标区域捕获测序 。通过ctDNA测序可以检测到多位点取样外显子测序的64.7%的突变位点，和组织目标区域捕获测序83.9%的突变位点。最终在70例肝癌病人中发现了38.6%的突变位点具有潜在治疗价值，这表明通过ctDNA测序可以克服肝癌瘤内异质性对突变检测结果的影响，成功地检测到肝癌潜在治疗位点。
文章题目：Circumvent ingintratumoral heterogeneity to identify potential therapeutic targets in hepatocellular carcinoma
研究人员：来自复旦大学附属中山医院肝癌研究所，复旦大学癌变与癌症侵袭重点实验室，BGI-深圳等多个研究团队
发表时间：2017.03.07
期刊名称：Journal of Hepatology
影响因子：12.486研究背景
肿瘤在靶向治疗方向的研究通常会受到瘤内不同组织取样的异质性的影响，而cfDNA能够综合性的反应某种肿瘤的全部突变信息。
HCC只有一部分早期患者能够得到有效的治疗，对于晚期HCC患者来说，索拉非尼的治疗效果很差。所以，本文探索能否通过基因测序辨别出索拉非尼敏感的HCC患者以及筛选出对其他药物敏感的突变位点。
组织活检具有局限性，首先组织活检由于肿瘤内部存在异质性，不同位点的组织取样样本的突变信息会有很大差异，不能均一全面的反应肿瘤的突变信息。其次在肿瘤的发生发展过程中，会不断的有新的突变产生，通过组织多次取样实现起来比较困难。总的说得来，液体活检能够多次重复取样，实时监控评测治疗效率，所以在肿瘤的治疗过程中cfDNA越来越被广泛接受与使用。
鉴于目前基于NGS测序探索HCC肿瘤异质性及如何避开肿瘤异质性去发现治疗靶点的研究很少，本文通过WES和TDS测序分析HCC多位点组织样本的DNA突变数据来研究HCC的异质性。并同时提取cfDNA样本测序，将组织样本和液体活检样本的数据进行比较。文章的研究成果有望在以后转化为临床实践用于筛选HCC患者潜在治疗靶点。
研究方法
样本选择：
原发且没有伴随其他的恶性肿瘤
没有进行过抗癌治疗
经过组织病理确诊HCC
每个病人取6块癌组织样本，一块癌旁组织以及术前血液样本
研究手段：
WES & TDS(WES and TDS(targeted deep sequencing) were performed on Illumina Hiseq 4000)：5个肝癌患者，样品从32个位点组织取样。
术前cfDNA
对组织活检的测序结果和cfDNA的测序结果进行一致性比较。
研究成果
发现高深度的TDS组织取样测序结果的异质性百分比显著低于WES数据(28.1%vs 34.9%, P <>
TDS测序，平均检测每个组织位点的突变数据量约占所有位点检测突变数据量的70%。
cfDNA数据发现37.1%的患者存在潜在治疗靶点。
图1 研究概览
不同测序策略下瘤内异质性情况
WES突变数据
1.基本统计结果
平均深度：211.3X
1220个高可信突变位点（mutated allele frequency (MAF) >=5% intumor and<=0.5% in="" normal="">
2.mutation signature
不同病人间的mutation signature差异明显大于相同病人不同区域的。
HCC-07和 HCC-09：混合型signature。
HCC-10 和 HCC-12 ：signature 22，与马兜铃酸相关。
HCC-11 ：signature 24，与黄曲霉毒素B1相关。
没有发现突变与HBV感染，肿瘤大小，分化及门静脉癌栓的相关性。
3.突变分类
突变分布情况如图1。突变分为以下三类：①普遍存在于所有区域的突变，②只存在于一个区域的的突变，③剩下的突变称为异质性突变。
肿瘤内部异质性水平通过非普遍存在的突变的平均深度来界定。WES上整体上的瘤内异质性34.9%。HCC-07和HCC-10瘤内异质性水平比较低（分别是26.3%和11.6%），HCC-09, HCC-11和 HCC-12瘤内异质性水平比较高（分别是62.0%, 52.5%和 50.6%） 。
图2 五个HCC样品，多位点取样，突变基因及功能原件展示
查看瘤内异质性是否会随着测序策略的不同发生改变
1.TDS基本统计
平均深度：681.1x
94.7%的WES突变在TDS中得到印证。TDS每Mb的突变数目（12.02-292.43/Mb）显著高于WES结果(1.07-9.41/Mb)。
TDS新鲜组织瘤内异质性水平较WES结果显著下降（TDS：28.1%, P <>
TDS FFPE样品瘤内异质性水平较WES新鲜组织样品结果略有升高（FFPE TDS 35.9%，p=0.47）），整体略高是因为HCC-09一个样本导致的，剩余样品瘤内异质性为27.4%。
总结
瘤内异质性的水平与样本和测序策略有关。TDS对HCC组织样本测序，能捕获大约70%的基因组突变信息。
因为癌旁组织可能包含一些低频突变，相比于血液单核细胞做对照，HCC特有的变异结果在相对高深度TDS中少于WES中的结果。也进一步揭示了癌旁组织并不能作为严格意义上的对照。相比于肿瘤组织特有的SNVs，非特有的在HCC呈现高突变频率的突变可能是后续出现的致癌突变。
CNV和进化分析展示瘤内异质性
CNV（如图3A，3B）
1.方法
分析cnv，并用低深度WGS数据进行验证。
2.结果
8q24.3 和 11q13扩增, 8p23.1 和 16q缺失在HCC样品中多次出现，说明这些区域与肿瘤的发生发展存在相关性。
HCC-09和HCC-11样品CNV发生异质性，但是这些异质性也是发生在相同的染色体区域。
CNV的异质性与SNV存在紧密相关性，暗示CNV可能和SNV存在相同的发展进程。
图3 五个HCC样品 CNV分布情况
进化
肿瘤进化树用于构建瘤内异质性可视化及展示肿瘤发生发展进程。每个样品的进化树详见图4A.
Driver 突变筛选条件：高频突变，出现在TCGA和ICGC数据库中，符合高可信度标准的非同义突变。最终得到34个潜在的driver 基因。详见图4B。
图4 五个样品的进化树及driver gene突变情况展示
HCC中cfDNA基因组效率情况分析
WES
平均深度：226.2X
发现1310个SNVs，53.3%通过数字PCR技术得到验证。822个SNVs出现在组织活检样本的高可信突变数据中。cfDNA能够发现平均67.4%的在多组织取样样品中的突变结果，见图5A。
TDS
平均深度：1806.7X
发现861个SNVs。验证通过率高达83.9%。组织样本在五个样品中普遍存在的突变和在四个样品中异质性的突变均在cfDNA TDS结果中得到验证，详见图5B。
说明cfDNA TDS测序比单位点组织取样TDS测序更具潜力。
图5 cfDNA突变及组织活检突变结果分别在WES和TDS两种测序策略下的一致性展示
发现潜在的治疗靶点
样品
66个HCC患者（组织取样）+4个不可动手术的HCC患者（cfDNA），其中65人具有HBV感染。
对照组：血液中的单核细胞。
策略
TDS（508个gene的panel）
结果
发现255个基因（>=1个病人中出现），平均一个样本7.1个突变。
基于已知的治疗靶点的证据将患者按照突变情况分为三种类型：1、索拉非尼敏感位点（4/70）2、FDA印证的其他类型肿瘤一致的突变(22/70) 3、药物还在临床试验阶段的相关突变位点(1/70)，发现38.6%（27/70）的患者具有潜在的治疗靶点（以上三类治疗靶点）。
讨论
基于cfDNA在耐药性，预后预测和临床用药等方面有着广泛的应用，本文探讨cfDNA是否能够克服肿瘤异质性更好更全面的揭示HCC的基因组信息。
HCC不同位点存在瘤内异质性，可以通过更高深度的测序降低异质性。在足够的深度下测序，每个组织位点取样平均可以发现70%的突变信息。这70%的突变信息基本包括了全部的已知靶向突变和driver genes，揭示在治疗早期TDS对单位点的组织测序能获得足够的HCC突变信息应用于靶向治疗。
虽然cfDNA比单位点组织取样测序检测到突变的效率低，但是其检测靶向突变gene突变的效果与组织取样测序相当或者表现的更好。
单位点组织取样测序研究HCC突变情况成为避免瘤内异质性的首选，cfDNA在不能进行手术治疗的患者中成为最优备选方式，并能起到实时动态监测的作用。
进一步比较组织和cfDNA检测突变的一致性需要在扩大样本量的基础上，综合考虑更多的因素，例如测序深度，基因panel的大小，样品分类和cfDNA提取等等。
参考文献：
[1] Ao Huang,Xin Zhao, et al. Circumvent ingintratumoral heterogeneity to identify potential therapeutic targets in hepatocellular carcinoma[J]. Journalof Hepatology, 2017,67(2):293–301.
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