定量蛋白质组学方法有非标定量（Label-free）和标记定量（iTRAQ/TMT、SILAC和同位素二甲基标记）。这期我们介绍这几种定量蛋白质组学方法：
一 iTRAQ/TMT
iTRAQ/TMT定量是目前定量蛋白质组学应用最广泛的技术，该技术的核心原理是多肽标记和定量，从而简化了定量的复杂性，最终通过多肽定量值回归到蛋白的定量值，从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。
iTRAQ/TMT定量不依赖样本，可检测出较低丰度蛋白，胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等，且定量准确，并可同时得出鉴定和定量的结果，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。
iTRAQ和TMT的结构与区别，iTRAQ和TMT是近年来应用最广泛的差异蛋白质组学技术，它们均采用体外标记的方法，利用同位素试剂标记蛋白质酶解后产生的多肽，对两个或多个样本，在全蛋白质组层面上展开相对定量分析。二者区别只是不同厂家生产的标记试剂盒（iTRAQ是AB SCIEX研发，TMT是Thermo Fisher研发），在标记规格（iTRAQ是4标和8标的；TMT是2标、6标以及10标的）、标签分子结构上有些许差异，其他原理基本一样。
iTRAQ/TMT试剂均由三部分组成：质量报告基团、质量标准化基团和氨基反应基团。相应的标记数对应着相应个数的不同分子量的质量报告基团，比如TMT10标有10种不同的分子量质量报告基团，质量标准化基团也10有种不同的分子量，与不同的报告基团搭配，能保证被标记的不同来源的同一肽段在一级质谱中具有相同的质荷比；氨基反应基团能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接使肽段连上标记。一级质谱中，任何一种TMT试剂标记的不同样品中的同一肽段表现出相同的质荷比；二级质谱中，可切割键（箭头所指）断裂释放出TMT报告离子，在质谱低质量区产生了10个TMT报告离子峰，其强度反应了该肽段在不同样品中的相对表达量信息，另外二级质谱中的肽段碎片离子峰质荷比反应了该肽段的序列信息；这些质谱原始数据经过数据库检索，可得到蛋白质的定性和相对定量信息。
由于iTRAQ或TMT技术上的限制，最多标记10个样品，我了解的公司可以做到11标，所以，当样品数超过10个的时候就需要设置内参，以矫正不同批次之间的批次差异（搭桥技术）。比如：做18个样品，则需要做成两组10标的进行上机，每组9个样品加1个内参（内参是多个样品的混样或标准品），总共需要做的样品数就是9+9+1+1=20个。
在通量方面一般iTRAQ 4标>TMT 6标>iTRAQ8标>TMT 10标，当然这个跟公司的实力也有关系，也有iTRAQ4标>TMT 6标>TMT 10标>iTRAQ 8标的出现。
二 SILAC
SILAC定量的基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(中性或重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。
不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的面积比较进行相对定量，属于体内代谢标记法。
SILAC属于体内标记技术，更接近样品真实状态，标记效率高达100%，且标记效果稳定，不仅适合于进行全细胞蛋白分析，还适合于膜蛋白的鉴定和定量，每个样本只需要几十微克的蛋白量。
SILAC定量适用于活体培养细胞的分析，对多个样品或同一样品不同条件下全细胞蛋白或亚细胞蛋白进行差异比较。
三 Label-free
Label-free定量，即非标记的定量蛋白质组学，不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。
Label-free定量不需要标记处理，操作简单，可以做任意样本的总蛋白质差异定量，但对实验操作的稳定性、重复性要求较高，准确性也较标记定量差。因此，Label-free技术适合于大样本量的定量比较，以及对无法用标记定量实现的实验设计。
最后我们能来梳理下这三种技术的优缺点：
Label free无需同位素标记，不受样本条件的限制，定性没有问题，但是定量的准确性不高，会受到质谱重复性等因素的影响，对于组织本身蛋白量不高，可以选择Label free，毕竟价格比较便宜，另外对于想得到处理组和对照组蛋白有无的情况，只能选择Label free。
SILAC体内标记技术，标记效率可高达100％，定量重复性好，用量少，适合于膜蛋白的鉴定和定量，最大的优点，活体标记，更接近样品真实状态，缺点也很明显只适用于活体培养的细胞，而且周期长，花费大，对于生物医学研究中常用的组织样品，体液样品等无法分析，对于动物模型的标记成本太大，无法实现。
iTRAQ/TMT的覆盖度高、灵敏度高、重复性好。但是在混标上机时要充分考虑样品的情况，样品数量较多时，实验设计会较为复杂。相对于 SILAC 体内标记技术漫长的同位素氨基酸替换周期，基于 iTRAQ/TMT的体外标记技术避免了前期漫长的实验处理，极大缩短了实验周期。所以iTRAQ/TMT适用于任何类型的样本；一次最多能标记10个样本，优点也很明显通量高，有的物种像小麦可以定量到11000个蛋白（小编接手过的项目，嘿嘿）
三种技术的区别
这期就到这里，那我们下期介绍下样品制备和疑难问题解答！再见。
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