小巧的Cas14蛋白有望成为新型诊断工具

CRISPR-Cas或许连自己都想不到，如今会变得这么红。它原本只是细菌体内的适应性免疫系统，现在却能够编辑几乎任何生物的基因组。近年来几种Cas酶陆续进入人们视线，但这也许只是冰山一角，科学家预测还有许多酶是未知的。

于是，CRISPR领军人物、加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna研究团队开始探索新型且高效的Cas系统。他们分析了宏基因组数据集，试图确定是否天然存在更小巧的Cas酶。他们最终发现了比Cas9小得多的Cas14。

这项题为“Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes”的研究成果于11月发表在《Science》杂志上。

在这项研究中，Doudna领导的研究团队挖掘了微生物基因组和宏基因组数据库。这个数据库来自美国能源部的联合基因组研究所。他们发现了CRISPR-Cas系统的一个家族，其中包括cas1、cas2、cas4和新基因cas14。cas14编码了大小仅为40-70 kDa的Cas蛋白，大约是其他Cas蛋白的一半。

cas14基因有24个变异，可分为三个亚组（cas14a-c）。所有这些变异都存在预测的RuvC核酸酶结构域，这是CRISPR-Cas酶的特征。与其他Cas酶不同，Cas14不存在于细菌基因组中，只存在于古细菌基因组中。因此，研究人员预测与更大更复杂的Cas9和Cas12蛋白相比，Cas14可能是更原始的版本。

那么，这个新系统的功能是什么？是否能够成为基因组编辑的新工具？为了检验Cas14的潜力，研究人员将cas14基因连同相邻的CRISPR array和基因间区域克隆到质粒上，并在大肠杆菌中表达。

他们发现Cas14能够结合并切割单链DNA的目标序列。与Cas9不同，Cas14不需要PAM序列。除了这种顺式切割，Cas14还能够不加选择地反式切割单链DNA，类似于Cas13和Cas12。不过，他们发现Cas14在识别单链DNA方面比Cas13或Cas12更具特异性，需要gRNA中间有一定的序列特异性才能激活。

研究人员认为，Cas14的切割对象是单链DNA，而不是双链DNA，因此未必是良好的基因组编辑工具。不过，他们认为Cas14可用在DETECTR诊断工具中。这种工具是由Doudna实验室开发的，它利用Cas12和Cas13来快速检测病原体序列和遗传突变的存在。例如，利用病毒序列特异的gRNA，这种酶被激活并切割荧光探针。荧光信号表明病毒序列的存在。

“对于分子诊断，你希望能够靶向双链DNA、单链DNA和RNA，”第一作者Lucas Harrington谈道。“Cas12特别擅长识别双链DNA，Cas13擅长识别单链RNA，现在Cas14完成了另一个任务，因为它擅长识别单链DNA。”

若在这种混合物中加入Cas14，那么RNA、双链DNA和单链DNA都可以检测。通过比较Cas12和Cas14检测SNP的能力，他们发现Cas14的特异性增加可实现高保真的SNP基因分型。他们认为，Cas14-DETECTR有望实现快速高效的传染病、癌症等疾病的诊断。

原文检索

Harrington, Lucas B., et al. 'Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes.' Science 362.6416 (2018): 839-842.

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