HB-EGF是EGF家族中的一员，在发育和组织再生中起着重要作用，但其在骨骼干细胞和骨骼中对发育和生长的作用尚不清楚，在此，我们使用Cre/LoxP系统在Dermo1+间充质间质细胞及其后代（包括软骨细胞和成骨细胞系细胞）和骨髓间质细胞中消融或表达HB-EGF（包括软骨细胞和成骨系细胞）。Dermo1-Cre；HBG-EGFf/f小鼠的骨量仅略有增加，而Dermo1-HB-EGF小鼠则发展为进行性软骨发育不良、软骨瘤、骨关节炎样关节缺陷以及骨量和密度的 缺损，这些都通过用EGFR抑制剂AG1478治疗得以缓解。软骨细胞特异性HB-EGF过度表达（Col2-HB-EGF）小鼠软骨缺损的严重程度较轻。Dermo1-HB-EGF小鼠增殖增加，但软骨细胞和成骨细胞分化有缺陷，HB-EGF通过Akt1和Erk途径促进BMSC增殖，但通过抑制Smad1/5/8活化抑制BMSC分化。然而，Dermo1-HB-EGF小鼠显示出正常的破骨细胞生成和骨吸收。这些结果揭示了自分泌或旁分泌HB-EGF在间充质间质细胞增殖和分化中的重要作用，提示需要严格控制EGF信号来维持骨和软骨的完整性。
方法与结果：
1、与骨髓间充质干细胞相比，HB-EGF在成骨细胞和软骨细胞中的表达降低。
图1. 与骨髓间充质干细胞（BMSCs）相比，HB-EGF在成骨细胞和软骨细胞中的表达降低。（A）WB结果显示，体外诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞时，HB-EGF水平下调。在分化培养基中培养不同时期的骨髓间充质干细胞，并采集、洗涤、和溶解细胞进行蛋白质印迹分析。HB-EGF的低谱段可能是截断形式。在凝胶下显示HB-EGF条带的定量数据，第0天的数值设置为1.0。（B）WB结果显示，当诱导骨髓间充质干细胞分化时，HB-EGF水平下调。在成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞的分化培养基中培养WT-BMSC7天，收集细胞进行Western blot分析。HB-EGF的低谱段可能为截断形式。HB-EGF条带的定量数据显示在凝胶下，BMSCs的值设定为1.0。（C）生长板、小梁骨和骨膜股骨段HB-EGF表达的免疫染色。比例尺条=20μm。箭头表示软骨细胞或成骨细胞。（D）对于1个月和6个月大的Dermo1-Cre小鼠，在骨切片上追踪Dermo1系细胞；tdTomato小鼠。股骨切片用DAPI染色。比例尺条=50μm。
2、HB-EGF在Dermo1+细胞中的过度表达导致软骨瘤、软骨和关节缺陷。
图2.HB-EGF在Dermo1+细胞中的过度表达导致软骨瘤、软骨和关节缺陷。（A）两个月大的HB-EGF过度表达小鼠身体体积较小（右图）。WB结果显示，HB-EGF在Dermo1-HB-EGF小鼠的骨髓间充质干细胞中有很高表达（左图）。HB-EGF的低谱段可能为截断形式。HB-EGF条带的定量数据显示在凝胶下面，控制值设置为1.0。（B）两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠与对照组相比体重有所下降。n=8。（C）两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠的体长比对照组小。n=8。（D）两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠的股骨长度比对照组小。n=8。（E）两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠的股骨宽度比对照小鼠大。n=8。（F）2个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠膝关节组织学显示严重的关节形成缺陷。切片为H/E染色。比例尺条=200μm。（G）Safranin O染色显示2个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠胫骨生长板周围有多处软骨瘤样病变。右图：框中显示的区域的高放大率视图。比例尺条=200μm（左图）和20μm（右图）。（H）2月龄Dermo1-HB-EGF及对照小鼠股骨关节表面FSP1的免疫染色。比例尺条=50μm。（I）1月龄Dermo1-HB-EGF小鼠和正常小鼠生长板的H/E和Ki67染色。右图：定量数据。n=4。比例尺条=50μm。（J）在1个月大的Dermo1- HB-EGF小鼠和对照组小鼠股骨生长板和关节软骨上对col2和col10进行免疫染色。右图：定量数据。n=4。比例尺条=50μm。（K）组织学分析显示，2个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠生长板和关节软骨的缺陷随着时间的推移而增加。用H/E法对不同年龄的Dermo1-HB-EGF小鼠和对照组小鼠股骨进行切片和染色。
3、HB-EGF在软骨细胞的过度表达导致中度软骨缺损。
图3. HB-EGF在软骨细胞的过度表达导致中度软骨缺损。（A）WB结果显示，HB-EGF在软骨中高度表达。取骨骺切片，均质化，进行免疫印迹分析。HB-EGF的低谱段可能为截断形式。在凝胶下面显示HB-EGF条带的定量数据，其控制值设置为1.0。（B）2个月大的Col2-HB-EGF小鼠与对照组相比体重正常。n=4。（C）2个月大的Col2-HB-EGF小鼠与对照小鼠相比，体长正常。n=4。（D）两个月大的Col2-HB-EGF小鼠股骨长度比对照组小。n=4。（E）两个月大的Col2-HB-EGF小鼠的股骨宽度比对照组小鼠大。n=4。（F）H/E染色显示2个月大的Col2-HB-EGF小鼠膝关节有中度缺损。骨切片用H/E染色。比例尺条=200μm。（G）组织学分析显示2个月大的Col2-HB-EGF小鼠生长板厚度增加。右图：定量数据。n=4。比例尺条=50μm。（H）免疫染色显示1个月大的Col2-HB-EGF小鼠生长板中的ki67+软骨细胞增加。比例尺条=20μm。（I）免疫染色显示2个月大的Col2-HB-EGF小鼠在生长板和关节软骨处的Col2-和Col10-阳性软骨细胞略有增加。下图：定量数据。n=4。比例尺条=50μm。
4、HB-EGF在Dermo1+细胞中的过度表达导致与成骨细胞分化和矿化缺损相关的骨量减少。
图4.HB-EGF在Dermo1+细胞中的过度表达导致与成骨细胞分化和矿化缺损相关的骨量减少。（A）2个月大的Dermo1-HB-EGF和对照小鼠股骨的显微CT图像。（B）两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠显示中轴皮质骨厚度增加。n=8。（C）2个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠和对照组小鼠股骨内、骨膜周的显微CT结果。n=8。（D）两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠显示BMD降低。n=8。（E）两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠显示骨体积减少。n=8。（F）两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠小梁骨数量减少。n=8。（G）两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠显示小梁骨厚度减小。n=8。（H）两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠显示小梁骨分离增加。n=8。（I）两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠的钙蛋白双重标记降低。（J）两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠显示骨形成率下降。n=8。（K）与对照组相比，VillanuevaGoldner的股骨切片三色染色显示两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠皮质骨矿化缺损。右图：定量数据。比例尺条=20μm。箭头表示类骨。（L）免疫染色显示2个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠的骨表面和小梁骨的Colα+成骨细胞减少。TB=小梁骨；CB=皮质骨。比例尺条=20μm。（M）定量PCR结果显示，2个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠的骨干中Col1α和osx表达降低。n=4。
5、AG1478抑制EGFR对Dermo1+—HB-EGF小鼠软骨和骨缺损的修复作用。
图5.AG1478抑制EGFR对Dermo1+-HB-EGF小鼠软骨和骨缺损的修复作用。（A）WB结果显示，AG1478抑制了Dermo1-HB-EGF小鼠骨髓基质细胞中的EGFR活化。从小鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞，并用蛋白印迹法进行分析。小鼠从1个月大开始接受AG1478治疗2个月（A-K）。（B）AG1478挽救了Dermo1-HB-EGF小鼠膝关节的异常形态。（C）AG1478挽救了Dermo1-HB-EGF小鼠股骨长度的减少。n=4。（D）AG1478挽救了Dermo1-HB-EGF小鼠股骨宽度的增加。n=4。（E）Safranin O染色显示，AG1478挽救了异常生长板和关节软骨，软骨瘤Dermo1-HB-EGF小鼠显示AG1478挽救了异常生长板和关节软骨以及软骨瘤Dermo1-HB-EGF小鼠。比例尺条=200μm。（F）AG1478挽救了Dermo1-HB-EGF小鼠关节软骨厚度的减少。n=4。（G）AG1478挽救了Dermo1-HB-EGF小鼠生长板厚度的增加。n=4。（H）AG1478挽救了Dermo1-HB-EGF小鼠的BMD下降。n=8。（I）AG1478挽救了Dermo1-HB-EGF小鼠骨体积的减少。n=8。（J）AG1478挽救了Dermo1-HB-EGF小鼠小梁骨数量的减少。n=8。（K）AG1478挽救了Dermo1-HB-EGF小鼠皮质骨厚度的增加。n=4。
6、HB-EGF促进BMSC增殖但抑制分化。
图6.HB-EGF促进BMSC增殖但抑制分化。（A）AG1478挽救了Dermo1-HB-EGF小鼠皮质骨厚度的增加，集落形成效率测定显示两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠可以形成集落的BMSCs数量增加，用结晶紫染色板。右图：定量数据。n=3。（B）从2个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠中分离出的BMSCs显示出增殖增加，表现为Ki67+细胞的增加。在对数期生长的细胞被固定并用抗ki67抗体染色。在右图中显示了Ki67+细胞的数量，这些细胞被标准化为细胞核的数量。n=3。（C）Dermo1-HB-EGF BMSCs显示成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化减少，通过ALP、茜素红和Von-Kossa染色判断成骨细胞分化，通过Alcian蓝染色判断软骨细胞分化，通过油红染色判断脂肪细胞分化。（D）定量PCR显示，Dermo1-HB-EGF BMSCs显示成骨细胞特异性标记物表达下降。诱导骨髓间充质干细胞分化，然后在第5天收集进行qPCR分析。n=3。（E）定量PCR显示Dermo1-HB-EGFBMSCs显示软骨细胞特异性标记物表达下降。n=3。（F）定量PCR显示，Dermo1-HB-EGF BMSCs显示脂肪细胞特异性标记物表达下降。n=3。（G）骨髓干细胞移植实验表明，HB-EGF抑制了骨髓干细胞的成骨分化，HB-EGF表达的Dermo1系骨髓干细胞和用HA/TCP支架控制的骨髓干细胞被移植到体外，6周后切除并用h/e染色。箭头表示骨形成的部位。右图：结果的定量。b:骨头；OB：成骨细胞；ad：脂肪细胞。n=3。（H）微量分析显示，HB-EGF抑制BMSC软骨分化。同样数量的HB-EGF表达Dermo1系BMSCs和对照BMSCs被诱导分化成软骨细胞，3周后用甲苯胺蓝染色。箭头表示软骨细胞。
7、HB-EGF通过Akt1/Erk促进BMSC增殖，通过Smad1抑制分化信号传递。
图7.HB-EGF通过Akt1/Erk促进BMSC增殖，通过Smad1抑制分化信号传递。（A）WB结果表明，从Dermo1-HB-EGF小鼠分离的BMSCs显示Erk和Akt1的激活增强，而Smad1/5/8的激活降低。（B）IHC染色证实两个月大的Dermo1-HB-EGF小鼠骨切片显示p-Erk和p-Akt信号增加。比例尺条=20μm。（C）在原代BMSC培养中，HB-EGF激活Erk和Akt1，用50ng/ml HB-EGF和（加或不加）10μm Ag1478处理BMSC 5、10、15或30分钟，然后进行免疫印迹分析。（D）HB-EGF抑制BMSC培养中Smad1/5/8的激活。用50ng/ml HB-EGF处理BMSCs，加或不加10mmAg1478处理1、2、4或8小时，然后进行免疫印迹分析。（E）ERK或AKT1的抑制作用抑制了HB-EGF诱导的BMSC增殖。用50ng/ml HB-EGF和10μm U0126、100nM沃曼宁、100ng/ml BMP2或10μmAg1478处理BMSCs，用CKK8分析细胞增殖情况。数据提供为平均值±标准差。*p<0.05 ，=""><0.01。n=3。（f）bmp2挽救了hb-egf抑制的bmsc的成骨和软骨分化。用50ng l="" hb-egf和10μm="" u0126、100nm沃曼宁、100ng/ml="" bmp2或10μm="" ag1478处理成骨或软骨分化培养基，培养bmscs。随后进行alp和甲苯胺蓝染色。（g）定量pcr结果显示，bmp2挽救了hb-egf抑制的bmsc的成骨和软骨分化。n="">
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