简化RNA样本的ddPCR实验流程，就靠它了！

对于RNA样本检测分析，通常需要先进行RNA反转录（RT）合成cDNA。在推出伊始，对于RNA的分析，微滴式数字PCR（ddPCR）也需要先RT，然后再以cDNA为模板，进行微滴生成等后续操作，即RNA反转录和ddPCR实验分两大步骤。

然而，上述两大环节却可以一步完成，没错，RNA反转录在小小的微滴里面进行，即One-step RT-ddPCR。

别激动，先看看下面三份应用报道

Detection and Quantification of BCR-ABL1 Fusion Transcripts by Droplet Digital PCR

Lawrence J. Jennings, David George, Juliann Czech, Min Yu, and Loren Joseph

The Journal of Molecular Diagnostics, March，2014

DIO: 10.1016/j.jmoldx.2013.10.007

概要：已有研究证实了对慢性粒细胞白血病 ( CML) 患者进行 BCR-ABL1 融合基因转录水平定量的临床意义。然而，由于 RT-qPCR 技术的检测下限（LOD）无法满足对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs) 有良好反应的 CML 患者进行疗效监控和用药指导的需要。该研究通过设计 BCR-ABL1 融合基因和BCR 基因引物探针，采用 RT-ddPCR 技术检测分析每个样本中 BCR-ABL1/BCR 的比例，再计算出 %IS 值，来确定治疗效果（完全分子反应或其他）。RT-ddPCR 技术数据显示出优秀线性、准确度和精确度，灵敏度低至 0.001％。

Development and application of a reverse transcriptase droplet digital PCR (RT-ddPCR) for sensitive and rapid detection of Japanese encephalitis virus

Xulong Wu, Hua Lin, Shijie Chen, Lu Xiao, Miao Yang, Wei An, Yin Wang, Xueping Yao, Zexiao Yang

Journal of Virological metrods, Jun 9,  2017

DOI: 10.1016/j.jviromet.2017.06.015

概要：日本脑炎/乙型脑炎是由日本脑炎病毒（JEV）/乙型脑炎病毒引起的，经蚊子传播的中枢神经系统急性传染病，是一种人畜共患病。实验室通常采用血清或脑脊液为样本来检测病毒特异性抗体来反映病毒含量。但如果要在防治工作中贯彻“早发现、早治疗”的原则就需要一种快速、灵敏的病毒检测方法。来自四川农业大学联合四川省出入境检验检疫局的的研究工作者分别采用 RT-qPCR 和 RT-ddPCR 两种技术对 103 例猪样本（包括内脏组织，脑脊液，流产物，精液和血液等）进行了 JEV 定量。经分析表明 RT-ddPCR 在灵敏度方面比 RT-qPCR 技术高出 逾100 倍，且可快速提供准确的结果。可实现对猪舍生殖衰竭疾病的快速检测，有利于保障公共卫生安全。

Characterization of oseltamivir-resistant influenza virus populations in immunosuppressed patients using digital-droplet PCR: Comparison with qPCR and next generation sequencing analysis

Maxime Pichon, Alexandre Gaymard, Laurence Josset, Martine Valette, Gilles Millat, Bruno Lina, Vanessa Escuret

Antiviral Research, Jul 31, 2017

DOI: 10.1016/j.antiviral.2017.07.021

概要：奥司他韦（又名“达菲”）是一种神经氨酸酶抑制剂。被美国 FDA 和中国 NMPA 等批准用于预防和治疗流感，然而神经氨酸酶 H275Y ( H275Y-NA）变异会使感染 H1N1 病毒的患者获得奥司他韦耐药性，因此需要在这类免疫抑制患者中监测 H275Y 变异含量。本研究旨在比较RT-qPCR、RT-ddPCR 和 NGS 技术在突变定量方面的性能表现。首先采用已知浓度的 275H （WT）和 275Y（MUT） RNA 按照不同比例混合成 13 份样本，通过对比三种平台的检测结果，发现 RT-ddPCR 技术检测结果准确性更高；然后针对两例临床上具有免疫抑制的患者（已故），取得奥司他韦治疗期间不同时间点的样本，采用上述三种技术进行 H275Y 变异检测，以NGS 结果作为参照（测序深度 >100X）。结果发现RT-ddPCR 的表现优于 RT-qPCR 技术，并提示ddPCR 技术可作为病毒耐药性管理——测序技术的一种替代方法。当然，作者最后表示针对 H275Y-NA 情况，只有在出现新的治疗方案后，ddPCR 技术在对流感患者全程管理方面的优势才能更好凸显出来。

以上三份报道的共同之处就是使用了一步法试剂盒——One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes，可一步完成RNA样本的反转录及ddPCR实验过程。小编想说，其实该试剂盒早在QX100时代就已推出了，旨在高效、特异、灵敏地定量RNA靶标。

特点及优势

• 独特的热启动逆转录酶，使反应体系设置更加简便

• 反转录过程在大约50℃条件下进行，有利于特异性cDNA合成

• 热稳定的酶可使RNA模板的逆转录和扩增在同一反应管中完成

• 含有RNA酶抑制剂，可全程保护RNA样本不被降解

试剂盒线性、灵敏度测试

采用RT-ddPCR for Probes一步法试剂盒，线性好、灵敏度高。A. EEF2基因，B. GAPDH基因，RNA样本经2倍梯度稀释（5ng-310fg/20μl），QX100系统检测，每个梯度设置6个重复样本，结果显示重复性、线性均好；灵敏度低至1 copy/μl。数据来自Bio-Rad Bulletin 6250。

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