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该研究基于比较自由噬菌体组与前噬菌体组和网络分析的方法，揭示了肠道系统中细菌和噬菌体的“嵌套-模块化”的进化结构，研究思路很新颖，故事形象生动，对于研究各个生态系统中溶源化的生态和进化影响具有很好的启发作用。
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溶源性是普遍的且广泛分布于鼠肠道微生物
Lysogeny is prevalent and widely distributed in the murine gut microbiota
作者：Min-Soo Kim, Jin-Woo Bae
时间：2018.4.1
期刊：The ISME Journay
IF: 9.520
DOI: 10.1038/s41396-018-0061-9
噬菌体是肠道微生物组的中心成员和潜在的调节剂；然而，肠道细菌和噬菌体的生态和进化关系知之甚少。在此，作者通过从共生细菌的宏基因组重建的基因组中的前噬菌体来研究C57BL/6J小鼠细菌群落中溶源性细菌（溶源菌）的丰度和多样性。作者比较了前噬菌体基因组与游离噬菌体的宏基因组数据，以研究溶源菌和前噬菌体的活性。在不同分类群中大多数共生细菌被鉴定为溶源菌。相比拟杆菌门和放线菌门，在厚壁菌门和变形菌门中发现了更多的溶源菌。前噬菌体基因组与自由噬菌体的宏基因组具有高度的序列相似性，表明大多数溶源菌似乎具有活性，并且预先作为活性噬菌体自发诱导；饮食干预改变了前噬菌体的组成。相比之下，CRISPR-Cas系统存在于少数共生细菌中，并且很少对肠道噬菌体具有活性。细菌-噬菌体感染网络的结构是“嵌套模块化的”，模块化在各个分类学水平内出现，表明温和型噬菌体特征已经在很长的系统发育时间尺度上发展。作者得出结论，具有广泛宿主范围的噬菌体会导致肠道生态系统中溶源性的流行。
肠道微生物群被认为是宿主生理和代谢的潜在调节因子。虽然微生物介导的宿主表型是由于不同类型微生物之间的相互作用的结果，但是大多数微生物组研究都集中在细菌上。病毒是肠道微生物群的核心成员，噬菌体群落组成部分占人类粪便宏基因组的17%且噬菌体和共生细菌一样多。宏基因组学研究表明，温和型噬菌体是人类和小鼠肠道宏病毒组中主要且适应的成员，其组成的改变与微生物相关疾病有关，肠道噬菌体对宿主健康和疾病中扮演着重要角色。预计噬菌体的温和行为将显著影响肠道微生物组的组成和功能，为了验证这一点，作者首先需要评估溶源性的程度，并确定细菌和噬菌体如何在肠道生态系统中相互作用。
细菌-噬菌体相互作用是细菌生理和代谢的核心，促进了细菌群落的遗传多样性和进化。噬菌体通过裂解破坏宿主细胞，在宿主间转移基因，通过溶源转化修饰宿主表型。由于感染方式的不同，对温和型噬菌体的研究远远少于裂解型噬菌体。用丝裂霉素C诱导前噬菌体后生成的病毒粒子和溶源细胞计数来估计溶源性的程度；但是该方法仅适用于可培养的细菌，且由于溶源噬菌体的不成功诱导，导致其准确性较低。因此，环境群落中溶源菌的鉴定和定量仍然具有挑战性。从宏基因组数据中恢复基因组是一种可从异质宏基因组序列中产生数十至数百个基因组草图的新兴技术，该技术不仅能够连接内源微生物的功能和分类数据，也允许组装未培养的微生物谱系的原位基因组。由于温和型噬菌体是宿主基因组的一部分，因此从宏基因组数据中原位恢复定居细菌的个体基因组提供了研究包括肠道微生物组等天然微生物群落中溶源性的机会。
本文检查了肠道细菌和噬菌体群落中共生溶源菌及其前体的丰度和多样性。作者基于粪便细菌宏基因组重建的细菌基因组中的前噬菌体检测，对溶源菌进行了分类，并评估了细菌群落中原位共生溶源菌的优势。使用在无菌水和动物饲料维持的无特定病原体C57BL / 6小鼠，以最大限度地减少对肠道定居微生物群落的外源污染。获得了两组肠道噬菌体群体的基因组数据集：一组潜伏的噬菌体，整合在宿主细菌基因组中（整合的溶源噬菌体）；和另一组活性噬菌体，在宿主细菌外自由存在（自由噬菌体）。还建立了细菌宏基因组的溶源组分，并通过对游离和整合的噬菌体数据集的序列比较来鉴定活性溶源菌和溶源菌。最后作者利用噬菌体-溶源噬菌体联系来预测主要溶源化的肠道生态系统中的细菌-噬菌体感染模式。
1. 动物实验
动物实验由庆熙大学的机构动物护理和使用委员会批准。无特定病原体的编号为C57BL / 6J 的4周龄雄性小鼠（n = 6，日本SLC，日本）保持在通气的塑料隔离器中（温度25± 1 °C 、相对湿度48 ± 6%和一个14h白天/10h黑暗循环的光照设置），供给经消毒的食品和水。由于饮食是肠道细菌和噬菌体群落的强大驱动力，故使C57BL / 6小鼠经历连续的饮食转变（图1）。
图1. 两组（FORTH和BACK）C57BL/6小鼠（3个一组）连续3周喂养三种不同类型的饮食
先用低脂肪饮食（LFD）喂养小鼠三周，之后将小鼠分为三组（3个一组）；一组（FORTH）接受高脂肪、高蔗糖的饮食三周，另外一组（BACK）接受低脂肪、高植物多糖的饮食三周。饮食再次转为要么高脂肪、高蔗糖的饮食（HFHS）或者低脂肪、高植物多糖的饮食（LFPP）并用来喂养小鼠三周。最后，将饮食转为低脂肪饮食（LFD）用来喂养小鼠三周。在每个阶段的第三周收集每个个体约0.5 g粪便，并立即储存在-80℃。
2. DNA提取和全基因组鸟枪法测序
将粪便样品悬浮在经0.02 μm过滤的镁盐缓冲液中，4℃下以2500×g离心5分钟将悬浮液分成沉淀和上清液。该步骤重复四次，然后将样品再次以5000×g在4℃下离心10分钟获得病毒和原核生物完全的分离（图2），沉淀物用于细菌宏基因组的DNA提取。将上清液用于病毒样颗粒纯化（0.45μm过滤）和病毒宏基因组的DNA提取。用细菌16S rRNA基因特异性引物通过定量PCR评估宏病毒组DNA中的细菌污染。使用Illustra Genomiphi V2 DNA扩增试剂盒扩增宏病毒组DNA，细菌和病毒DNA基于Illumina HiSeq4000测序仪（2×101 bp）测序。
图2. 基于从宏基因组序列重建细菌基因组，前噬菌体检测和噬菌体基因组比较等鉴定溶源菌及其活性的流程
3. 细菌宏基因组的从头组装、装箱和校正
原始reads经质量过滤，保留了每个细菌宏基因组（n = 24）的平均值（±SD）为4.0±0.5 Gb的高质量reads（图2）。使用IDBA-UD对双末端reads进行共组装，并使用MetaBAT基于四核苷酸频率和丰度信息对组装好的序列进行装箱，得到484个草稿图质量的基因组（bacterial bins）。使用CheckM的“merge”，“outliers”和“modify”命令来校正细菌bins，得到456个bins（图3）。
图3. 181个细菌bins的基于四核苷酸频率的散点图
通过mapping分析，选取能够mapping校正后bins的scaffolds中reads数最多的宏基因组样品，并对该宏基因组样品中reads进行重组装。使用CheckM的谱系特异性单拷贝基因工作流程评估细菌bins的完整性和污染度，滤掉完整度<30％且污染度> 10％的bins；最后获得了181个细菌bins。
4. 整合溶源性噬菌体的检测和自由噬菌体的宏基因组组装
使用VirSorter对细菌bins的scaffolds中的溶源性噬菌体序列进行预测。为减少假阳性率，作者仅仅保留拥有至少一个病毒标记基因，或富集有病毒样基因或非有尾噬菌体目的预测结果（category 1 and 2 in entirely viral; category 4 and 5 in prophages）。对噬菌体宏基因组（n = 24）的原始reads进行质量过滤，以获得细菌宏基因组中描述的高质量的双末端的reads。
5. 蛋白簇和病毒簇
收集两个参考数据集：4485个源自RefSeq数据库的DNA病毒基因组（RefSeq_viral）；和12498个源自5492个微生物基因组（RefSeq数据库）中的溶源性噬菌体基因组（RefSeq_proph）。噬菌体宏基因组、溶源性噬菌体基因组和两个参考数据集中基因组的蛋白质按至少60％序列相似性和80％比对率进行聚类。基于共享基因内容的网络分析创建病毒簇，这可以产生接近属水平的病毒种群。该分析分别以1361和287个非冗余的噬菌体和原噬菌体基因组的长contigs（≥3 kb）为基础进行分析。基于相互BLAST匹配计算蛋白质序列相似性，并使用马尔可夫聚类算法定义蛋白质簇。使用vConTACT基于蛋白簇计算基因内容相似性并生成病毒簇。
6. CRISPR-Cas阵列鉴定
使用PILER-CR预测细菌bins中CRISPR阵列。使用CRISPRTarget参数将间隔区与噬菌体宏基因组的contigs进行比较。选择在整个间隔区上完全或几乎完全匹配（最多两个不匹配）以与原型间隔区精确匹配的间隔区。
7. 病毒tRNA的鉴定
使用ARAGON在噬菌体宏基因组的contigs中鉴定tRNA基因的序列。使用BLASTn分析比较tRNA序列和细菌bins的scaffolds，且完美匹配的tRNA被认为是显著的。
8. 细菌-噬菌体感染网络分析
使用FALCON且基于“the nestedness temperature calculator（NTC）”方法计算嵌套性指数，使用R包中的“lpbrim”函数且基于“the Bipartite，Recursively Induced Modules（BRIM）”方法去计算模块性指数。
9. 统计分析
p值<0.05为显著。使用prism 5="" for="" windows（graphpad="" software，usa）且基于不成对的双尾student’s检验确定细菌bins丰度的差异。使用spearman等级相关性计算细菌分类的基因组的完整性和大小与溶源菌百分比和丰度的相关性。基于jaccard非相似性使用r包“vegan”对活跃的溶源型噬菌体进行了主坐标分析，且基于bray-curtis非相似性对溶源菌和非溶源菌进行了主坐标分析（pcoa分析）。使用函数“adonis”（999个排列置换）对beta多样性的统计学显著性进行估算。使用one-way="" anova分析和tukey’s="" post-hoc="">
1. 从宏基因组数据集中恢复细菌的基因组
图4. 共生溶源菌的分类学分布
使用宏基因组组装和binning过程，获得了一个由181个共生细菌bins（基因组完整度>30%且污染度<10%）组成的微生物群落。根据保守标记基因的系统发育分析，这些细菌bins被分类为厚壁菌门（133个bins）、拟杆菌门（36个bins）、放线菌门（4个bins）、变形菌门（4个bins）、软壁菌门（1个bin）、脱铁杆菌门（1个bin）、疣微菌门（1个bin）和未知的类群（1个bin）（图4>
2. 共生溶源菌的优势地位
图5. 肠道细菌群落中共生溶源菌的分布和丰度
基于病毒“标记”基因的存在去计算预测前噬菌体序列。总共从119个细菌bins（65.8%）中预测到336个前噬菌体（12,914 ± 12,460 bp, mean ± SD）；这些被认为是溶源菌的bins（图5 b）。溶源菌bins的丰度（53.6±2.4％）高于非溶源菌bins的丰度（46.4±2.4％）（图5 c），且溶源菌bins的丰度随着基因组完整度和基因组大小的增加而增加（图5 b）。这里观察到的溶源菌比例远大于公共可获得的细菌基因组中溶源菌比例（46-54%的基因组是溶源菌），这暗示着前噬菌体广泛分布于共生细菌之中。溶源菌bins的百分比和丰度与基因组完整度和大小呈正相关关系（图6），暗示着数据集提供了一个对于共生细菌中溶源菌实际数目的最小估计。
图6. 181个细菌bins的基因组完整度与基因组大小和溶源菌bins的百分比和丰度平均值的相关性分析
作者通过比较溶源菌和非溶源菌中各个bins的平均丰度来检查共生溶源菌的适应性后果，因为温和型噬菌体的携带对于它们的宿主来说可能是昂贵的。溶源性总bins的平均丰度显著低于非溶源菌，但是对于完整度>70%或者基因组大小>2 Mb的细菌bins这些差异就会消失甚至反转（图7 a），尽管溶源菌的比例增加。
图7. 溶源菌和非溶源菌单个bins平均丰度的比较
3. 共生溶源菌的分类学偏好性和饮食响应
溶源菌分布广泛分布在所有观察到的细菌分类群上，但非溶源性分类仅限于少数细菌分类群（图5 d）。为了确定优先溶源化的细菌类群，作者检查了不同细菌门中溶源菌bins的分布。结果发现溶源菌bins广泛分布于所有的细菌门类中，且在拟杆菌门（18.2-25.8%）和放线菌门（25.0%）中的分布少于厚壁菌门（77.4-87.7%）和变形菌门（100%）中的分布（图4 a）。这些结果暗示着溶源性在特定的细菌类群中可能是有利的，这些细菌类群可以是属水平甚至更低水平。
接下来确定了溶源性和非溶源性菌bins的丰度的饮食变异。根据基于Bray-Curtis非相似性的PCoA分析结果，发现溶源菌和非溶源菌bins的丰度受饮食类型的影响。丰度的变化与LFPP饮食更相关而不是LFD或HFHS饮食（图8 a和b）。
图8. 溶源菌和非溶源菌群体丰度的饮食变化
HFHS饮食增加厚壁菌门（梭菌和杆菌）的丰度，同时LFPP饮食增加拟杆菌门的丰度（图8 c、d和e）。溶源菌bins在喂养HFHS饮食的小鼠中丰度更高，同时非溶源菌bins在喂养LFPP饮食的丰度更高（图8 a和b）。较之非溶源菌bins而言，饮食的种类对梭菌的溶源菌bins的变异做出了更大的贡献（图8 c），尽管饮食的种类对杆菌和拟杆菌门中溶源菌bins和非溶源菌bins的变异做出了相似的贡献（图8 d和e）。
4. 从共生溶源菌诱导产生的前噬菌体形成了噬菌体群落中的一部分
作者比较了共生溶源菌的原噬菌体基因组与游离噬菌体的宏基因组，以估计活性噬菌体集合中前噬菌体的比例。由噬菌体宏基因组编码的蛋白质首先基于序列相似性的比较进行聚类；这生成了2348 ± 2106个蛋白簇并伴随着455 ± 1411个单体。然后将代表性序列与来自原噬菌体基因组和两个参考数据集（Refseq_viral和RefSeq_proph）的蛋白质序列进行比较。大部分蛋白簇（89.7 ± 4.3%）与这三个数据库的蛋白质之间没有明显的相似性（图9 a）。
图9. 整合的前噬菌体和自由噬菌体之间高度的序列相似性
蛋白簇可被Refseq_proph（55.2 ± 2.6%）、整合的前噬菌体（51.1 ± 3.0%）和Refseq_viral（12.9 ± 1.8%）注释（图 9 b）。许多病毒contigs（76.7 ± 9.2%）没有编码这三个数据库中的蛋白质（图 9 a）。鉴定出的contigs被Refseq_proph（72.4 ± 2.3%）和被整合的前噬菌体（52.6 ± 2.5%）以及Refseq_viral（18.5 ± 1.5%）注释到（图 9 b）。这些数据暗示着肠道噬菌体群落的遗传内容由大部分未被表征的前噬菌体相关基因所主导。
接下来，使用一个基于共享基因内容的网络分析创建病毒簇，生成了184个病毒簇并伴随589个单体。结果发现，98个病毒簇与这三个数据库中的任何一个基因组没有任何联系（图9 a），暗示着很大一部分肠道噬菌体种群有待研究。就基因组的数目而言，数据库高度偏向于Refseq_viral和Refseq_proph。前噬菌体的注释效率（与自由噬菌体的序列同源的序列数目与参考序列的总数目的百分比）至少高于数据库Refseq_viral和Refseq_proph的14倍（图9 c），推测原位诱导的多样共生细菌的前噬菌体可能贡献了肠道噬菌体群落的大部分。
为了验证这个，作者将游离噬菌体的宏基因组reads与前噬菌体片段进行比对（BLASTn，相似性>95%和比对率>90%），假如比对上即认为前噬菌体是诱导的且细菌bins是活跃的。结果，99个溶源菌bins（83.2%）的234个前噬菌体（69.6%，每一个噬菌体宏基因组38,856 ± 13,121个reads）是活跃的（图10 a），且这些活跃的前噬菌体广泛分布于共生溶源菌的所有类群之中，除了疣微菌门（图10 b）。病毒簇的网络图也提供了整个群落范围的噬菌体-原噬菌体连接概述（图11）。这些连接不限于某种病毒簇或细菌类群，且很少在纲或者更高的细菌分类水平上被观察到，暗示着溶源性在紧密的细菌-噬菌体特异性约束力中发生。
图10. 在活跃的共生溶源菌中前噬菌体是自发地被诱导
图11. 游离噬菌体和整合的前噬菌体的基因组序列的病毒簇网络可视化
5. 自由噬菌体和整合的前噬菌体的分类学多样性
图12. 噬菌体组和前噬菌体组的病毒分类学信息
总体而言，113个自由噬菌体簇（61.4%）和46个整合的前噬菌体簇（65.9%）在科或者更低的水平上未能得到注释（图12 a）。自由噬菌体之中，长尾噬菌体科（42.7%）和肌尾噬菌体科（40.4%）贡献了群落的时间稳定性，且是丰富的，整合的前噬菌体之中，长尾噬菌体科（42.7%）和肌尾噬菌体科（40.4%）在不同的细菌类群之中都是占优势地位的，尽管短尾噬菌体科仅仅只在变形菌门中被检测到（图12 c）。
6. 自由噬菌体和整合的前噬菌体的分类学多样性
为了分析溶源性和CRISPR-Cas系统之间的关联，作者使用CRISPR重复区域鉴定方法搜索了细菌bins之中的CRISPR阵列。和前噬菌体的分布相反，CRISPR阵列仅仅只在45个细菌bins（24.9%）之中出现（图13 a），这几乎是公共可获得细菌基因组CRISPR阵列数的一半（47%）。
图13. CRISPR系统在细菌bins之中的分布
作者接下来通过在噬菌体宏基因组中搜索原型间隔区序列来探索活性CRISPR阵列；作者发现11个细菌bins之中的所有间隔区的仅仅6.5%（60/920间隔区）与病毒序列显示了精确的配对（图13 b），这暗示着肠道噬菌体没有经受过共生细菌的CRISPR-Cas系统。尽管CRISPR阵列或者前噬菌体的出现与前噬菌体片段或者CRISPR间隔区的数目无关（图13 c），CRISPR间隔区和前噬菌体片段的数目之间的负相关关系是明显的（图13 d）。这符合溶源菌倾向于在CRISPR阵列中有更少的间隔区，而非溶源菌更可能在CRISPR阵列之中有许多间隔区。
7. “嵌套-模块化的”细菌-噬菌体感染网络
细菌-噬菌体感染网络模式可以预测潜在的生态和进化过程。病毒簇的噬菌体-前噬菌体连接允许作者去定义细菌-噬菌体感染，导致34个病毒簇的宿主分配。使用一个由50列（病毒簇）和98行（细菌bins）组成的二元邻接矩阵，作者检查了细菌-噬菌体感染网络的嵌套性和模块性。这些网络分析揭示了细菌-噬菌体感染模式的嵌套性（NNTC = 0.97）和模块化（Q = 0.66）。“嵌套-模块化”的感染模式与细菌和噬菌体拮抗性的共进化模式相似，如此噬菌体已经由专一者进化为通才者，且细菌-噬菌体的相互作用在模块约束力之下多样化为多尺度结构。因此，“嵌套-模块化”感染模式反映了肠道噬菌体容易与共享相似的由等位基因变异所概括的遗传模块的共生细菌相互作用，且这些相互作用的大部分会导致溶源化。
图14. 病毒簇和细菌bins之间的细菌-噬菌体互作网络
目前的研究旨在使用基因组分辨率的宏基因组分析、测量肠道细菌和噬菌体宏基因组中活性共生溶源菌和前噬菌体。通过从宏基因组数据中捕获重建的细菌物种基因组中的原噬菌体基因组，发现大多数多种细菌类群的共生细菌是溶源菌。通过比较集成前噬菌体和游离噬菌体的两个宏基因组数据集，作者确定了肠道环境中的溶源菌活性和前噬菌体诱导，提供了共生细菌可以作为肠道噬菌体群落的遗传库的证据。而且，这些前噬菌体介导的细菌-噬菌体联系基于网络分析确定了肠道系统中发展的共生互作的生态和进化关系成为可能，揭示了类似于海洋细菌和噬菌体的拮抗相互作用的“嵌套-模块化”的进化结构。
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