免疫检查点抑制剂可提高部分晚期肿瘤的疗效，给肿瘤治疗带来了新的治疗手段，但临床应用中发现，许多病人对免疫检查点抑制剂天然或继发性耐药。具体的耐药机制尚不明确，特别是肿瘤基质细胞是否在细胞耐药中有发挥作用。杜克大学药学和细胞生物学部（Department of Pharmacology and Cell Biology ）的Brent A. Hanks教授课题组发现成纤维细胞在肿瘤耐药的作用机制，发现了其中的关键分子以及具体的信号通路。
以前的研究发现并证实，转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β)在肿瘤微环境中具有促进疾病进展的作用，它的作用机制是抑制患者的免疫功能，如诱导Treg、抑制效应T细胞等。肿瘤性成纤维细胞（Tumor-associated fibroblasts, TAFs）是肿瘤微环境免疫抑制的重要组成成分，它的作用机制多种多样，如建立物理屏障阻止免疫细胞浸润、直接抑制T细胞生成、分泌细胞因子形成肿瘤微环境免疫抑制状态等。基于此，本文作者探索了黑色素瘤肿瘤微环境中TAFs、TGF-β信号分子的作用机制，以及它们在BRAFV600E突变黑色素瘤中对免疫检查点抑制剂耐药的影响。
作者首先制备了自体BRAFV600E突变黑色素瘤模型，并且使用CTLA-4抑制剂治疗无效(Fig. 1A)。采用IHC和WB检测肿瘤组织中表达TGF-β(Fig. 1B)。考虑到TGF-β具有抑制免疫功能的作用，作者采用TGF-β受体色氨酸/苏氨酸激酶抑制剂（TBRI）阻断TGF-β信号通路，结果显示并未抑制肿瘤生长(Fig. 1D)，但同时使用TBRI和CTLA-4检查点抑制剂，原发肿瘤生长受抑，肺部转移病灶减小，荷瘤小鼠生存期延长(Fig. 1E)。分析肿瘤浸润细胞成分，发现CD8+ T细胞增加，Treg减少(Fig. 1F)。数据显示阻断TGF-β可改变肿瘤微环境中细胞成分，解除免疫抑制，因此可以增强CTLA-4检查点抑制剂的抗肿瘤疗效。
图1 阻断TGF-β信号通路增强CTLA-4检查点抑制剂的抗肿瘤疗效
而针对另一种免疫检查点分子PD1/PD-L1，单用PD1/PD-L1检查点抑制剂有一定的抗肿瘤疗效，同时使用TBRI和PD1/PD-L1检查点抑制剂疗效不增加(Fig. 2A, B)。深入研究发现，自体BRAFV600E突变黑色素瘤模型高表达浸润性CD8+T细胞以及PD-L1，这就是单用PD1/PD-L1检查点抑制剂有一定的抗肿瘤疗效的原因。而使用TBRI后，肿瘤组织PD-L1表达下降，因此，同时使用TBRI和PD1/PD-L1检查点抑制剂疗效不增加。
图2 阻断TGF-β信号通路不增强PD1/PD-L1检查点抑制剂的抗肿瘤疗效
继续研究TBRI对机体免疫的影响，发现经TBRI治疗后的肿瘤组织基质成分增加，其中黑色素瘤成纤维细胞（Melanoma-associated fibroblasts, MAFs）数量显著增加。TBRI促进MAFs增殖导致肿瘤微环境基质扩增。
图3 阻断TGF-β信号通路增加MAFs
前文证明，同时使用TBRI和PD1/PD-L1检查点抑制剂疗效不增加，并且使用TBRI后MAFs数量增加，研究者假设MAFs与PD1/PD-L1检查点抑制剂有相关性。因此在体内将MAFs与BRAFV600E突变黑色素瘤细胞株共培养后，结果发现能促进肿瘤生长，并且同时降低PD1检查点抑制剂的疗效(Fig. 4A)。检测肿瘤组织，发现效应CD8+ T细胞数量减少（Fig. 4B），并且降低CD8+ T细胞识别肿瘤相关抗原能力（Fig. 4C）。对RNA测序分析显示，MAFs降低了与免疫反应相关的基因表达（Fig. 4E）。
图4 MAFs抑制PD1检查点抑制剂在BRAFV600E突变黑色素瘤的疗效
TBRI抑制PD1检查点抑制剂的疗效是因为TBRI导致PD-L1表达下调，同时伴有MAFs的增加，那么MAFs的增加能否导致PD-L1表达下调？继续建造MAFs与BRAFV600E突变黑色素瘤动物模型，行流式细胞分析显示肿瘤细胞PD-L1表达下调（Fig. 5A），RNA测序发现基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）表达增加（Fig. 5C）。而有研究认为MMP-9可以下调PD-L1，使用MMP-9抑制剂后，PD-L1表达增加。基因敲除MMP-9，MAFs对PD-L1表达调控消失。
图5 MAF分泌MMP-9抑制PD-L1表达
继续制备PD-1检查点抑制剂耐药黑色素瘤模型，并分析转录组基因治疗后的肿瘤组织基因表达变化情况（Fig. 6B），发现治疗后许多基因表达发生了变化，综合分析后，发现TAF在基质中表达过量的TGF-β，过量的TGF-β与PD-L1检查点抑制剂耐药正相关，耐药的肿瘤细胞表现增强的TGF-β信号反应。
图6 TGF-β活化与PD-L1检查点抑制剂耐药正相关
上述实验预示TGF-β活化与PD-L1检查点抑制剂耐药正相关，在使用PD-L1检查点抑制剂失败后，应用TGF-β抑制剂能提高肿瘤疗效。继续采用动物模型验证这个说法，一组将制备的自体BRAFV600E突变黑色素瘤动物先行PD-L1检查点抑制剂，三周后给予TBRI，另外一组同时给予这两种药物。结果发现前一组能有效抑制肿瘤的生长，特别是对于有PD-L1检查点抑制剂耐药的动物，疗效更为显著。
图7 TGF-β抑制剂提高PD-L1检查点抑制剂失败后的肿瘤疗效。
综上，作者发现肿瘤，基质中成纤维细胞可通过MMP-9和TGF-β形成免疫检查点抑制剂耐药使用TGF-β抑制剂有望增强免疫检查点抑制剂抗肿瘤疗效，本研究结果有望为癌症免疫治疗提供新的方法。
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