免疫组化是常用的蛋白检测方法之一,是实验狗必备的技能之一。该实验可以真实的反应蛋白在组织或细胞中的定位,也可以比较不同条件下组织中蛋白相对表达量的变化。
免疫组化实验流程比较复杂,稍不注意就会导致结果的失败。下面给大家分享一些免疫组化实验需要注意的小细节。
细节一:组织切片样本制备
用于IHC染色的组织样本可以是冰冻切片,也可以是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片。
冰冻切片的优点包括是抗原结构和更快的处理时间,而缺点则是由于冷冻而造成组织形态学的丧失,以及需要冷藏。
FFPE组织易于处理,可在常温下长期保存,通常更适合于免疫组化,但缺点是蛋白质的交联往往需要抗原修复。
具体选择制备哪种切片通常要考虑样本处理能力、可用的冷藏设施、样本存档的需要以及抗体与抗原修复的兼容性等因素。
细节二:抗原修复的必要性
FFPE样品通常要求在IHC染色之前进行抗原修复,因为固定过程通常会导致抗原掩蔽。蛋白酶诱导的表位修复(PIER)涉及到用蛋白酶K、胰蛋白酶或胃蛋白酶等酶处理样本,但成功率相对较低,并可能损害组织形态。
热诱导表位修复(HIER),通常用微波或水浴进行,更受欢迎,但对时间、温度、缓冲液和ph等条件高度敏感。
冰冻组织样本通常不需要抗原修复。
细节三:如何选择合适的一抗
一抗的灵敏性和特异性对产生高质量的IHC数据至关重要。
不要假设一种适用于冰冻组织的抗体同样也适用于FFPE样品,反之亦然。抗体制造商通常指定抗体的哪一种样本类型已被验证,通常提供推荐的染色方案和验证数据。
一抗宿主的选择取决于组织样本的种属。例如,小鼠组织样本,一抗通常建议选择小鼠以外的物种,以防止抗小鼠二抗识别组织内源性IgG而导致的背景染色。
也可以选择酶或荧光团的直接标记的一抗进行染色。
如果对IHC抗体选择有疑问,可以参考Human Protein Atlas网站,这是一个开放的平台,可以提供细胞、组织和器官中所有人类蛋白的详细图谱,可以指导选择合适IHC抗体及阴阳性对照组织或细胞。
细节四:优化每一步实验
抗体的选择是免疫组化染色最关键的部分,而优化抗体浓度、孵育参数、稀释剂的选择以及实验流程中的其他步骤不应被低估。
此外,固定剂的类型、抗原修复方法、封闭和洗涤步骤都需要优化。同时也需要考虑阻断任何内源性酶活性的需要。
还需要选择合适的检测方法,例如结合链霉亲和素- HRP来放大生物素标记抗体的信号。
科学家们希望从珍贵的样本中获得更多的数据,以期获得更多发现。所以除了IHC实验本身的优化外,科学家们还在不断探索更多新的技术,如将质谱法结合到染色方案中可以促进抗原定量;在组织切片上研究mRNA表达水平,将蛋白和核酸检测的数据结合在一起。Duolink技术实现在组织原位进行蛋白瞬时互作和微弱互作的检测等。
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