循环肿瘤细胞的介绍（上）

众所周知，癌症是一类一直处于不断变化状态的疾病。因此能够实时的观察监测到这种变化意义就尤为重大。传统的病理检测方法虽然被认为是“金标准”但是这一检测方法需要手术后才能得到病理组织，进行检测。即使采用穿刺活检办法也不能完整的跟踪整个病程，而且会给病人带来极大的痛苦。尤其当肿瘤的原位灶很小的时候往往多次穿刺都不能准确地收集到肿瘤组织。介于以上原因，大家更多的把目光集中在了液态活检上。这一概念早在上个世纪七十年代就有人提出(Sorrells,1974)近来在癌症的研究上越来越突出其作用。液态活检顾名思义是指以包括血液、尿液、淋巴液、脑脊液腹水等体液在内的样本作为检测对象的一种检测手段。目前主要包括游离DNA(Cell free DNA),外泌体（Exosome）和循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells）三大类研究对象。Cell free DNA是血液中肿瘤细胞游离出来的DNA片段，数量稀少不易检测，虽然有相关报道显示Cell free DNA可以用于癌症的诊断，并使癌症可以提早被发现(Heitzer et al. 2013)，但是仍然会因为血液中含有较高的背景而难以达到检测所需的分辨率，并且无法探知Cell free DNA的来源，并不能提示肿瘤的发病部位。Exosome是一种包裹了核酸蛋白的囊泡，结构稳定但是不易稳定分离，很多标志物还在探索当中。循环肿瘤细胞发现的最早，而且作为这三类当中唯一的实体瘤，它们的在医学上的意义值得我们进行更加深入的探索。

循环肿瘤细胞的研究进展

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC)是包括除白血病和淋巴瘤来源的肿瘤细胞以外的所有类型的肿瘤实体瘤细胞在血液和淋巴管中扩散的肿瘤细胞。其实在很早之前就有人观察到了这一现象，Ashworth是第一个提出这一概念的人，他在一名因为癌症导致死亡的患者遗体内发现肿瘤细胞本身与血液中的肿瘤相同，这一事实表明同一个人体内可能存在的多种肿瘤的起源模式。(Ashworth,1869)但是由于当时技术的限制，对这一现象的研究并未能深入。

循环肿瘤细胞与癌症的转移

1889年Stephen Paget提出了关于肿瘤发生转移的著名的“种子土壤学说”，每一个癌细胞都必须被看作是一个有机体，活着并且有增殖的能力。当一株植物进入种子时，它的种子就会被带到各个方向，但是只有它们落在适宜的土壤上，它们才能生存和生长(Paget, 1889)。这一理论在(Hoshino et al. 2015)这一研究中得到了证实。这里的“种子”就是循环肿瘤细胞。在肿瘤转移之前，癌细胞从原发肿e瘤部位扩散到远处进入血液循环部位，为了使癌细胞到达遥远的地方，它们必须通过血液运输到那里。肿瘤的转移发生在原位肿瘤细胞释放出很小的肿瘤细胞进入外周血循环的时候(Stott et al.2010a;Riethdorf et al. 2008)。一旦进入血液循环系统，循环肿瘤细胞会向远端发生转移，贴着正常组织的基底进行滚动。直到找到合适的环境渗出进入远端器官在继发部位开始增殖(Chambers et al. 1995)。这样转移性肿瘤会形成了继发性瘤。因此，循环肿瘤细胞被认为是癌症发生转移的重要因素，也是导致癌症死亡的主要原因。转移可以描述为五个步骤：1、癌细胞从原发肿瘤脱离2、侵犯血液循环3、在循环中存活4、渗出进入远端器官5、在继发部位增殖。外周血中发现循环肿瘤细胞癌症患者常表示发生了转移(Allardet al. 2004)。上皮间质转化(EMT)是一个非常复杂的过程，通过细胞接触连接的重新排列，最终导致细胞粘附的丧失，从而导致细胞的去分化和运动能力的增强。在此过渡过程中，细胞将其上皮表型部分或完全转变为间充质细胞。在原发肿瘤内的单个细胞的上皮间质转化可能会促进肿瘤细胞从血管内血管进入血流，从而使细胞的迁移潜力增加了。事实上当肿瘤细胞进入血管并被血小板覆盖时，EMT也可能发生(Labelleet al.2011)。EMT通常被认为与癌症侵袭性有关，EMT可能增加肿瘤细胞迁移的能力(Thompson and Haviv,2011)。相反的过程，被称为“间充质上皮过渡”(MET)，被认为是在CTC在遥远的组织中稳定下来并开始在新的微环境中形成转移灶的过程中起着基础性的作用。到目前为止，对于控制EMT之间的精细平衡并在转移级联中相遇的触发机制，我们知之甚少(Bednarz-Knoll et al.2012)。

另一种理论是细胞从肿瘤中分离出来，成团的转移到远端(Fidler, 1973) (Liotta etal. 1976)。实时上循环肿瘤细胞团早在很多年前就被发现了(Cho et al. 2012;Ni et al.2013)。循环肿瘤细胞团包括2个或者以上甚至大于50个循环肿瘤细胞聚集在一起的肿瘤栓子(Krebs et al. 2011)。肿瘤栓子的形成更容易帮助肿瘤细胞转移到新的宿主部位(Labelle and Hynes, 2012)。循环肿瘤细胞团的意义已经被讨论了很久。在非小细胞肺癌患者身上发现了两个很有意思的特点。首先循环肿瘤栓子中没有发现凋亡的细胞，这说明循环肿瘤细胞栓子中的细胞生存能力更强。其次CTM缺乏增殖细胞，这可能使这些细胞对化疗的抗性比单细胞增殖强(Krebs et al.2011)。在小鼠模型上我们已经可以明确地得出，循环肿瘤细胞团就是从原发肿瘤游离出来的(Aceto et al.2014)。重要的是，循环肿瘤细胞簇内的细胞似乎是寡克隆来源的而并不是来自于同一个迁徙的细胞。CTC团的的转移能力显著增加。在关于乳腺癌的报道中，循环肿瘤细胞团与更短的无病进展和减少的总存活数有关。这些多细胞循环肿瘤细胞簇由高表达的plak血红蛋白，细胞膜相关的粘着蛋白是桥粒和粘附连接的主要成分。高表达plak血红蛋白的循环肿瘤细胞团使得它们在到达远端组织时更加容易存活下来(Bailey et al. 2012;Holenet al. 2012)。无论如何，血液中的循环肿瘤细胞都是与肿瘤发生远端转移的能力相关的。更具体的来说，CTC包含与癌症转移相关的信息(Alix-Panabières andPantel, 2013)。这一理论在乳腺癌结直肠癌肺癌和前列腺癌上都有体现(Cohen et al.2009) (Krebset al. 2011)。

循环肿瘤细胞的异质性

一些肿瘤细胞特别是具有干细胞特性的肿瘤细胞会发生细胞型变，这种机制在器官发生和伤口愈合过程中自然发生，但在其与肿瘤细胞传播的相关性方面仍未得到充分的解释。瘤内异质性是降低分子靶向治疗的疗效的主要原因，检测这种瘤内异质性的主要难点在于很难针对同一组织采取多次不同空间和时间的样本(Gazzaniga et al. 2015)。循环肿瘤细胞可能代替传统的病理检测手段，研究疾病进展期间肿瘤亚群并监测变化对治疗的反应。个别患者的循环肿瘤细胞在表达治疗靶标如HER2或EGFR的基因的状态方面表现出惊人的异质性(Wülfing et al.2006;Ignatiadis et al.2011)。这个异质性可能就是造成肿瘤细胞靶向治疗脱靶的主要原因。这些循环肿瘤细胞的异质性也可能包括影响新的靶向治疗的信号转导通路中的下游成分。比如KRAS的突变会影响EGFR的靶向治疗。PI3K的突变会影响HER2的靶向治疗。接受Trastuzumab的治疗可以减少CK19阳性表达并且对化疗产生耐药的循环肿瘤细胞，减少癌症的复发，提高患者的生存期(Georgoulias et al.2012)。

针对于循环肿瘤细胞的这种新的实时活检可以对循环肿瘤细胞的特定亚群进行分析，它可以彻底改变癌症的检测和治疗。循环肿瘤细胞存在多种来源比如肿瘤的原位灶或者来自转移灶，这些来源取决于癌症发展到了哪一个阶段。循环肿瘤细胞为原发部位和继发部位的肿瘤的靶向治疗提供了非常重要的信息，为患者的靶向治疗提供巨大帮助，比如监控针对HER2的靶向药物的药效(Alix-Panabièreset al. 2012)。

通常来讲，对于一个病人在选择靶向治疗之前都会先对肿瘤的原位组织的分子标志物的表达情况或者分子标志物的基因组突变情况做分析(Stoecklein and Klein, 2010)。然而由于肿瘤细胞的异质性和可塑性做出这一判断往往有非常大阻碍。有几项研究表明，转移的肿瘤细胞可能具有明显的与原发肿瘤的不同的表型和基因型(Pantel and Alix-Panabières, 2010)。

当前导致这种现象发生的可能是以下两个方面原因，一方面在原位组织上转移亚型的克隆细胞可能由于太小所以未能被观察到。另一方面随着时间的推移，转移的肿瘤细胞可能会获得额外的基因组特征，并独立于原发性肿瘤发展(Klein, 2009)。

直接分析转移的肿瘤细胞在病人接受昂贵的有副作用的治疗之前可以提供额外重要的信息。例如，关于雌激素受体的表达或CTC上的HER2致癌基因的信息可能有助于对内分泌治疗或治疗曲妥珠单抗（人表皮受体因子2的抗体）的分层和监测。越来越多的报告表明同一患者原发肿瘤和循环肿瘤细胞在表达这些目标的之间存在明显的差异(Klein, 2009)。越来越多的证据表明循环肿瘤细胞可以实时反映癌症的进展，这一信息癌症的系统性治疗中会有特别重大的作用。在未来，循环肿瘤细胞作为靶向药物的标志物有望为癌症患者人群提供特定的靶向治疗做出更大的贡献。因此实现将循环肿瘤细胞的异质性考虑进去，也许会为癌症复杂的耐药机制提供一个崭新的思路。

循环肿瘤细胞与癌症的诊断

大多数的癌症初期常常由于缺少明显的症状而难以被诊断，特别是当原位灶特别小的时候。比如影像学可以确诊80%~90%的处于乳腺癌初期的没有较明显症状的患者，降低了女性15%的死亡率。但是乳腺X光片仍然有着较高的假阳性率和假阴性率(Bednarz-Knoll et al. 2012)。在肺癌早期发现的研究中，计算机断层扫描(CT)降低7-20%的死亡率，但筛查准确率低96%为假阳性(Team, 2011)。此外，CT扫描会导致某些癌症的长期危险(Albert, 2013)。再比如前列腺特异性抗原(PSA)已被用于前列腺癌的早期诊断，但其诊断率过高。它是否有助于减少死亡还不得而知(Edwards et al.2010)。一些研究已经检测到早期癌症患者血液中的循环肿瘤细胞。比如Stott et al. 在早期前列腺癌中检测到了循环肿瘤细胞,Zhang et al.在早期肺癌患者中检测到了循环肿瘤细胞。在早期发现并根除转移细胞的能力显然具有降低癌症死亡率的潜力。患有癌症的患者来说，对血液中的癌细胞进行敏感可靠的检测和计数，有望为早期发现肿瘤侵袭和早期评估治疗效果提供强有力的诊断工具。循环肿瘤细胞存在于癌症病程的早期这使得其成为一种较强的预后和诊断因子(Murlidhar et al. 2017)。循环肿瘤细胞数是研究癌症早期筛选、监测疾病进展和癌症复发的治疗效果的有效工具(Pantel and Speicher, 2016)。循环肿瘤细胞在提供临床和结合下游分析的治疗信息上也有很大的潜力。越来越多的证据表明，进入血液循环的循环肿瘤细胞可能是一种较好的替代性生物标志物，不仅可作为预后指标，也可用于疾病的检测和监测(Maheswaran et al. 2008;Nagrathet al. 2007;Stott et al. 2010b)。

循环肿瘤细胞与个性化用药

一些研究建议单纯的循环肿瘤细胞计数不足以指导治疗决定，应对循环肿瘤细胞进行分子分析，以确定靶向治疗的方法(Smerage et al. 2014)。通过对循环肿瘤细胞的检测来确定比如KRAS、EGFR和HER 2等基因和雌激素受体(ER)基因的突变。单个循环肿瘤细胞与原发肿瘤之间的差异可能通过循环肿瘤细胞基因组与原发性和转移性肿瘤的比较来得出新的发现。体外培养患者来源的循环肿瘤细胞可以用于药敏试验(Zhang et al. 2017)，并可用于循环肿瘤细胞的多通道的蛋白质组分析(Jordan et al. 2016)。循环肿瘤细胞具有作为预测患者治疗效果、无进展生存率和总体生存率的生物标志物的潜在价值(Khoja et al. 2012;Riethdorfet al. 2007)。最近几年循环肿瘤细胞在许多研究领域中的应用已经获得了巨大的发展势头。进展包括新辅助化疗和辅助治疗的选择(Cristofanilli et al. 2004)，监测复发性疾病、检测药效生物标志物及识别新的治疗靶点，促进个性化医疗(Hoffmann et al. 2007;DeAlbuquerque et al. 2012)。考虑到超过90%的癌症都发生转移，而CTC又是癌症发生转移的先决条件，因此针对循环肿瘤细胞来进行癌症的治疗是可行的(Hughes et al.2012)。尽管传统的手术化疗等手段可以清除肿瘤的原位灶。但是转移形成的继发性肿瘤通常瘤体非常小在可以被影像学观察到之前都不容易被发现，直到他们再次被证明是致命的。因此，随着技术的发展现在的癌症治疗直接针对循环肿瘤细胞，在它们有机会形成继发性肿瘤之前，减少与转移相关的死亡可能会有的潜在的可能性。