胶质母细胞瘤是中枢神经系统最常见和最具侵袭性的原发性恶性肿瘤。目前其治疗措施主要是化疗和放疗，通过靶向增殖的肿瘤细胞，但也因此杀伤正常增殖的细胞导致毒副作用；而相对静息的肿瘤干细胞则有可能逃避这类常规的治疗策略。肿瘤干细胞的代谢特性与增殖期的肿瘤细胞和体细胞不同，快速增殖的肿瘤细胞依赖有氧糖酵解 ( 即众所周知的Warburg效应 ) ，但慢更新的肿瘤干细胞可能更依赖线粒体呼吸作为主要的能量来源。
氧化磷酸化 ( OXPHOS ) 在细胞的能量代谢中起着核心作用。OXPHOS由核基因组和线粒体基因组编码的90多种蛋白质组成。OXPHOS电子传递链由四种复合物(I到IV)组成，它们将TCA循环和脂肪酸氧化生成的电子从供体转移到氧。复合物I至IV将质子泵入线粒体膜间隙，增加线粒体膜内pH值，形成电压梯度。复合物V ( F0F1 ATP合酶 ) 利用质子梯度中储存的能量产生ATP。活性氧是电子传递链和ATP合成过程中产生的副产物，通过线粒体通透性转变孔 ( mPTP ) 等多种机制可以减轻其毒副作用。
近日，美国Memorial Sloan Kettering肿瘤中心的研究人员最近在《Nature》上报道了靶向氧化磷酸化来杀伤胶质母细胞瘤的首个全新小分子Gboxin，并可以有效致死胶质母细胞瘤干细胞。
大部分基于细胞的“抗癌”药物筛选研究主要是干扰有丝分裂、DNA复制或损伤修复。为了区分癌细胞和正常分裂的细胞，研究人员构建了基于原代胶质母细胞瘤细胞的高通量筛选体系。他们首先建立了一个自发的胶质母细胞瘤小鼠模型，在GFAP-cre转基因介导的重组下，三个GBM相关肿瘤抑制因子 ( Trp53、Pten和Nf1 ) 发生突变导致小鼠自发胶质母细胞瘤；然后将多个GBM肿瘤低传代球状培养物混匀成细胞池，建立原发性高通量GBM球状细胞系 ( High-throughput GBM sphere, HTS ) 用于高通量筛选，利用96-h Cell-Titer-Glo的方法在上述细胞上筛选了200,000个化合物。
为了排除非特异性或抗有丝分裂的毒性，他们还对初级低传代小鼠胚胎成纤维细胞 ( MEFs ) 、新生星形胶质细胞和初级脑室下区神经干细胞和祖细胞进行了差异性筛选，最终筛选出61个IC50在nM级别的化合物。S9 fraction和hepatocyte assays进一步复筛这61个化合物，得到了17个潜在药物代谢较好的化合物，并依据化学结构可改造性选定了最终的3个化合物，其中包括Gboxin。Gboxin ( IC50 = 150 nM ) 及其衍生物均可以特异性抑制HTS细胞的生长，且不抑制初生MEFs或星形胶质细胞的生长。
Gboxin处理 6小时后的几种常见的癌症相关信号转导通路中，发现ATF4上调，并在时间上伴随着磷酸化S6 ( phospho-S6 ) 水平的降低。加药处理24 h内，HTS细胞发生细胞周期阻滞，G1、G0与S期比值增加，3天后出现细胞凋亡的分子特征。因此，Gboxin引起了原代GBM细胞的快速和特异性反应，导致细胞死亡，且对原代MEFs或星形胶质细胞的中没有表现明显抑制生长的作用。
由于Gboxin持续给药后，HTS细胞的膜电位降低，而MEFs细胞没有。研究者进行了耗氧量 ( Oxygen Consumption Rate, OCR ) 测量，发现了Gboxin对OCR的抑制作用呈浓度依赖性变化，与OXPHOS的抑制剂一样有效。Gboxin对HTS细胞具有独特的杀伤性，它对MEFs和星形胶质细胞OCR耗竭会在30小时左右恢复；相反，OXPHO的抑制剂鱼藤酮、抗霉素 A和寡霉素均可急性和慢性地抑制所有细胞的OCR。这些数据表明，Gboxin可能是通过破坏HTS细胞中的代谢来发挥抑制作用。
研究人员利用Gboxin类似物偶联生物素 ( B-Gboxin, IC50 = 1530 nM ) 构建了用于把靶标识别的探针。质谱分析Gboxin、B-Gboxin和两者联合使用处理HTS细胞的pull down样品，确定Gboxin特异性相互作用的靶标是处于线粒体的蛋白。在58种潜在的蛋白质中，其中12种是OXPHOS机制的组成部分；来自所有OXPHOS复合物的成分都存在，其中以复合物V(拉下5个蛋白)最具代表性。他们使用复合物I、II、IV和V组分的特异性抗体进行相互作用的确认，与不同OXPHOS抑制剂对比发现，线粒体上的复合物V是Gboxin介导的细胞死亡的功能靶标。
利用Gboxin的光交联类似物 ( C-Gboxin， IC50 = 350 nM ) 发现，HTS细胞线粒体中C-Gboxin含量较高。相反，对Gboxin不敏感的MEFs显示C-Gboxin的线粒体积累有限，当加入CsA后，会导致C-Gboxin的线粒体积累。这些数据验证了前面的生化数据，表明Gboxin在肿瘤细胞线粒体中有特异性的积累，且是通过影响线粒体通透性来实现在线粒体的累积。
接下来，研究人员在三种独立的原代小鼠GBM培养物和三种GBM患者源性培养物上都测试了Gboxin的活性。结果显示，实验中所有的GBM细胞都对Gboxin的敏感，小鼠GBM细胞IC50更低，约为150nM，人类GBM细胞约为1μM。
他们还在常见的不同类型的人类肿瘤细胞系上检测Gboxin的效果。与野生型的MEFs和星形胶质细胞对Gboxin不敏感相比，大多数癌细胞系对gboxin敏感，并显示出一定的治疗效果。OCR检测证实了细胞系中Gboxin 处理偶联呼吸抑制。
为了更好的将Gboxin用于临床前研究，研究人员优化了其结构，获得了S-Gboxin ( IC50 = 470 nM ) ，具有良好的代谢稳定性，优异的血浆稳定性和药代动力学特性，适用于体内研究。在小鼠移植瘤模型上，HTS细胞移植后第3天或第14天开始给药S-Gboxin 10 mg/kg /天来评估其体内抗肿瘤活性。与对照组相比，使用S-Gboxin治疗的小鼠肿瘤体积、细胞密度和增殖均有所减少，存活率有所提高。使用S-Gboxin治疗的肿瘤降低了高级别胶质瘤标志物GFAP和OLIG2的表达。在基底膜基质的存在下，原发人GBM细胞也被注射到免疫缺陷小鼠的侧翼进行病人样本移植瘤模型的建立。在第3天检测到可见肿瘤后，每日给予S-Gboxin，给予10mg/kg/天，与对照组相比，肿瘤细胞生长明显减缓，细胞密度下降。
在原位瘤模型上，为了克服血脑屏障穿透性差的问题，使用导管输送药物来测试颅内抗肿瘤活性。原代小鼠GBM细胞经原位移植，然后进行为期两周的肿瘤接种期和术后恢复；在这之后，在注射部位植入导管，通过皮下微型泵原地输送S-Gboxin（ 每只鼠每天2.16μg ）。S-Gboxin治疗抑制肿瘤生长，表现为减少出血、细胞密度和增殖。组织病理学分析进一步显示高等级胶质瘤标志物表达降低。
研究人员还测试了两个独立的病人来源的异种移植 ( PDX ) 模型。从有症状的PDX小鼠P0身上收集新鲜的病人移植GBM，病人肿瘤1匀浆，病人肿瘤2分离成单细胞，原位植入到四只老鼠的脑中，每一只都没有额外的操作，获得P1。两周 ( 患者肿瘤1 ) 或四周 ( 患者肿瘤2 ) 后，植入微型泵将安慰剂或S-Gboxin输送到肿瘤区域。所有经载药治疗的小鼠均表现出发病症状 ( 41-65天 ) ，并被杀进行分析。S-Gboxin抑制GBM PDX的生长，表现为一般健康状况，降低细胞密度，细胞增殖和GBM标志物的表达。
尽管每天在体内给药超过四周或更长时间，但在使用S-Gboxin治疗的小鼠中没有发现体重减轻或明显的一般健康缺陷迹象。研究人员还检查了S-Gboxin颅内治疗后脑室下区神经干细胞生境的状况。对照实验显示，给安慰剂和Gboxin小鼠的内源性巢蛋白染色没有异常，而治疗后肿瘤内的巢蛋白阳性细胞明显减少。
从肿瘤样本发现新靶标先导化合物的筛选方法意味着发现的化合物可能更直接面向临床需求，从提高药理模型的“临床效果可预测性”。本研究发展的高通量筛选方法不同于我们常规使用的体外系统或者模式细胞系统，是利用体内瘤细胞来建立筛选，这个模型一方面更加近似于肿瘤发生的原生环境，另外这个模型还考虑到了潜在的肿瘤干细胞问题。
对于全新靶标的First-in-class药物发现而言，每一步都是前人未知的，虽然市场前景收益巨大，临床前即使在小鼠模型上有优异的效果，临床II期在人体治疗的结果才是真正的第一个考验。因此，利用更近似真实发病的药理模型和人源化评价方法，将大大提高药物在临床II期的折损率，考虑到我国庞大的临床资源，这将成为未来我国创新药物发现中一大优势。
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