化学位点选择性修饰可为蛋白功能与性质的多样化提供一个方法。其中半胱氨酸因其高亲核性与低丰度，十分适合用来进行功能性的修饰。作者在计算化学支持下，发现乙烯基和乙炔基吡啶氮的季铵化能将无反应性的试剂转化为快速及高化学选择性的半胱氨酸修饰试剂。
首先作者通过计算硫醇与胺与一系列亲电试剂的亲核加成反应，识别到烯与炔是潜在的反应基团。因巯基相对于氨基较低的pKa，在中性及弱碱性的条件下巯基会更多去质子化。
作者使用量子力学计算反应的激活自由能，发现2-乙烯基（或乙炔基）吡啶与硫醇有很差的反应活性，对一级胺则无反应活性。但一旦将其季铵化，对硫醇的反应活性将提高十亿多倍，与过去常用于半胱氨酸连接的马来酰亚胺及羰基丙烯酸衍生物类似。且预测结果显示赖氨酸比半胱氨酸有8 kcal/mol更高的能垒，带来完全的半胱氨酸选择性。
在小分子测试上验证了以上计算结果，季铵化后反应速率远大于季铵化前，且同时相对氨基表现出对巯基的高选择性。为避免形成烯的空间异构体，后续使用1-甲基-2-乙烯基吡啶进行蛋白上的修饰。在突触结合蛋白-1，膜联蛋白-V，泛素，白蛋白上，化学计量或稍过量的1-甲基-2-乙烯基吡啶在37℃反应1h能有95%以上的产率，且检测到所有半胱氨酸均被反应。即使在10倍过量下也测不到与赖氨酸反应的产物。
烯基吡啶也可在季铵化时引入炔基linker，进而通过click反应引入功能基团。作者将可被组织蛋白酶降解的二肽缬氨酸-瓜氨酸，self-immolating spacer对氨基苯甲酸氨基甲酸酯及细胞毒性药物MMAE与烯基吡啶相连，所得产物在5倍当量下与Thiomab抗体相连，发现连接物也具有特异性识别Her2阳性细胞的能力。
因这个试剂带电荷，因此可以使蛋白的净电荷+1。作者使用测量漂移速度的方法，发现带负电荷的白蛋白接上1-甲基-2-乙烯基吡啶后漂移速度减慢，验证了此结论。
文章作者：JGG
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