circularRNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA，其呈封闭环状结构，不易降解。circRNA分子富含miRNA结合位点，在细胞中起到miRNA海绵的作用，从而解除miRNA对靶基因的抑制作用，提高靶基因的表达水平。今天分享的文章是第二军医大学周伟平教授和杨富教授作为共同通讯作者发表在Journal of Hepatology上的一篇关于CircRNA在肝细胞癌（HCC）中发挥作用的文章。
作者首先采用RNA-Seq对比了HCC和ANL（adjacentnoncancerous liver）组织中circRNA的表达差异，从而发现了一个circRNA，命名为cSMARCA5，探讨了cSMARCA5在HCC生长和转移中的作用和机制。
1. 通过RNA-Seq分析的方法在人肝脏样品中鉴定circRNA
作者比较了5对HCC和ANL组织中circRNA的表达差异，鉴定出13686个差异circRNA，排除极低丰度后，确定了4727个circRNA。这其中，在circBase数据库中已经鉴定了4214个circRNA，另外513个circRNA本研究中首次发现的circRNA。4214个circRNA由来自2332个基因的蛋白质编码外显子组成，结合数据GSE14520和GPL3921对着2332个基因进行分析，结果显示，在236个差异表达的circRNA中，与ANL组织相比，在HCC中108个circRNA被上调，128个circRNA被下调。在这236个差异表达circRNA中，190个来自外显子。在190个外显子circRNA中，有163个circRNA其亲本基因可以从GSE14520和GPL3921获得。
为了验证RNA测序结果，作者挑选了8个表达上调、8个表达下调的circRNA进行了RT-qPCR验证，结果显示与RNA-Seq结果一致。
2. cSMARCA5在HCC中的特征
在以上鉴定的差异circRNA中，源自SMARCA5基因的外显子15和16的circRNA(cSMARCA5)是差异表达的最丰富的circRNA，另外虽然研究发现SMARCA5的pre-mRNA（pSMARCA5），mRNA(mSMARCA5)和蛋白表达水平被上调，但cSMARCA5在HCC中显著下调，表明HCC中cSMARCA5的低表达可能具有功能性。因此本研究选择cSMARCA5进行了进一步研究。
作者利用SMMC-7721细胞作为研究对象，通过提取RNA，并在逆转录中使用随机六聚体或寡聚（dT）18引物，发现，当使用oligo(dT)18引物时，与随机六聚体引物相比，cSMARCA5的表达显著下调，而m SMARCA5不显著，证明cSMARCA5没有poly-A尾巴。此外，cSMARCA5对RNase R具有抗性，表明cSMARCA5是环装的。荧光原位杂交实验显示cSMARCA5主要分布于细胞质。
3. cSMARCA5在HCC中的表达受到DHX9的调节
通过将SMARCA5基因的内含子14的序列与内含子16的序列比对发现其高度反向互补，分别称为I14RC和I16RC。为了测试I14RC和I16RC是否促进SMARCA5基因，将I14RC和I16RC的野生型或一系列缺失构建体分别克隆到pZW1载体中，用四种载体转染后，Northern印迹显示野生型载体过表达cSMARCA5，表明I14RC和I16RC对于产生cSMARCA5是必不可少的。
为了揭示cSMARCA5在HCC中低表达，而pSMARCA5，mSMARCA5和SMARCA5蛋白表达水平升高的原因，作者提出肝癌发生发展过程中可能cSMARCA5而不是mSMARCA5受到了RNA结合蛋白的转录后调控。
因此，作者在单独敲除三种人RNA结合蛋白：DHX9、ADAR1、QKI后，检测了HCC细胞中cSMARCA5的表达，结果显示，在敲除DHX9后，cSMARCA5明显上调，ADAR1和QKI对cSMARCA5无影响，且pSMARCA5和mSMARCA5没有显著变化。DHX9是一种核RNA解旋酶，通过结合反向互补序列并抑制其配对来抑制circRNA的产生。cSMARCA5在敲低DHX9时被上调，并且这种效应可以通过过表达DHX9来逆转，表明这种调控取决于解旋酶活性。组织学评分显示，在40个HCC组织中，cSMARCA5的表达与DHX9呈负相关。
4. cSMARCA5是预测OS和RFS的独立风险因素
通过RT-qPCR检测另一队列中163个人HCC及其相应的ANL组织的cSMARCA5表达水平，显示cSMARCA5表达较低的HCC患者在肝切除术后具有较差的总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）。总之，HCC中cSMARCA5的降低与肿瘤生长和转移相关，并可以作为HCC患者肝切除术后的独立预后标志物。
5. cSMARCA5在体外和体内抑制HCC生长和转移
CCK-8实验、划痕实验和Transwell实验显示，过表达cSMARCA5后，HCC细胞生长和迁移显著延迟。
通过构建cSMARCA5过表达细胞的裸鼠移植瘤小鼠模型，结果显示cSMARCA5过表达的肿瘤生长受到显著抑制。通过建立原位肝转移模型显示，与异性对照组相比，cSMARCA5过表达的模型组肝内转移显著减少，肺转移模型也显示cSMARCA5过表达的模型组肺转移显著减少。
总之，cSMARCA5在体外和体内可以抑制HCC生长和转移。
6. cSMARCA5可以作为miR-17-3p和miR-181b-5p的海绵发挥作用
为了检测cSMARCA5是否通过海绵作用与miRNA结合发挥作用，作者在SMMC-7721和Huh7细胞中，使用抗AGO2的抗体进行RNA免疫沉淀（RIP），显示cSMARCA5通过抗AGO2抗体而富集。
使用针对cSMARCA5的探针进行共沉淀，纯化了cSMARCA5相关RNA，并分析了该复合物中的29种候选miRNA。作者发现cSMARCA5与miR-17-3p和miR-181b-5p的特异性富集，表明miR-17-3p和miR-181b-5p是HCC细胞中cSMARCA5相关的miRNA。作者将miR-17-3p或miR-181b-5p的模拟物与cSMARCA5质粒共转染到HEK-293细胞中，miR-17-3p和miR-181b-5p使荧光素酶报告基因活性降低至少40%。使用生物素偶联的miR-17-3p或miR-181b-5p的模拟物进行pull down分析显示，cSMARCA5明显富集。双荧光原位杂交表明cSMARCA5和miR-17-3p、miR-181b-5p的共定位。
总之，cSMARCA5可以作为miR-17-3p和miR-181b-5p的海绵发挥作用。
7. cSMARCA5通过miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路抑制HCC的生长和转移
已有报道证实，miR-17-3p和miR-181b-5p可以促进HCC进展，并且某些HCC的肿瘤抑制因子是miR-17-3p和miR-181b-5p的靶标。因此作者猜想cSMARCA5抑制HCC发生和转移是通过下调miR-17-3p和miR-181b-5p实现的。
因此，在过表达或沉默cSMARCA5后检测了这些肿瘤抑制因子的表达。当cSMARCA5过表达时，miR-17-3p和miR-181b-5p的共同靶标TIMP3显著上调，当cSMARCA5被敲低时，TIMP3显著下调。TIMP3是一种肿瘤抑制因子，在HCC中下调，抑制HCC的生长和转移。作者发现外源miR-17-3p和miR-181b-5p可显著抑制TIMP3的表达，并且在cSMARCA5过表达后这种抑制效应被延迟。CCK-8结果显示miR-17-3p和miR-181b-5p可以促进肿瘤细胞生长，且这种作用可以被过表达的cSMARCA5逆转。
Transwell实验证明，miR-17-3p和miR-181b-5p可以促进HCC细胞迁移，且可以通过过表达cSMARCA5阻断。此外TIPM3的mRNA水平下调与HCC组织中cSMARCA5的表达成正相关。
总之，cSMARCA5通过miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路抑制HCC的生长和转移。
总之，本文使用RNA测序鉴定出一种HCC相关circRNA，cSMARCA5。发现其在HCC中下调且与预后不良相关。HCC中cSMARCA5的下调是由DHX9调控的。cSMARCA5在体外和体内均可以抑制HCC细胞生长和转移。cSMARCA5可以作为miR-17-3p和miR-181b-5p的海绵上调TIMP3的表达制HCC的生长和转移。
原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29378234
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