第二代测序技术和第一代Sanger测序法的原理都是基于边合成边测序的思想，而且在第一代的基础上保持了高精准度，而且降低了测序成本并提高测序技术速度，双脱氧链终止法测序人类基因组总共花费约30亿美元、3年时间，而使用第二代测序技术，同样的任务，只要花5000美元、10天左右就可以完成，甚至在2010年，Life Technologies公司宣布 Ion PGM 离子阱测序技术可在一天内完成人的基因组测序，只需花费1000美元。
下面介绍一下四种二代DNA测序技术：Roche公司的454测序技术、illumina公司的Solexa测序技术、ABI公司的SOLiD测序技术和Life Technologies公司的离子阱测序技术。
核心原理是基于检测DNA合成过程中释放的焦磷酸，从而鉴别是否有特定核苷酸整合到DNA的合成链中而发展的测序技术，因此该测序技术亦称焦磷酸测序技术。
首先将DNA待测样品打断成小的片段，并在小片段的两端加上不同的接头，通过生物素标记的接头提取单链DNA从而构建单链DNA文库，这些单链DNA通过接头序列可特异性地连接到不同的磁珠(磁珠上带有大量的与接头序列互补的引物)上，实现一个磁珠上只有一条DNA，将磁珠放置在油包水的PCR反应体系中，进行乳化PCR，扩增模板DNA。
将这些磁珠连同其上大量扩增的单链DNA转移到含有很多小孔的一种称作叫做PTP平板上，每个小孔只能容纳一个磁珠，然后开始测序反应。
以磁珠上的单链DNA为模板，每次加入一种dNTP，进行DNA合成反应。如果这种dNTP能与模板配对并延伸，那么在合成之后会释放出焦磷酸基团，焦磷酸基团会在腺苷酰硫酸APS的存在下由ATP硫酸化酶催化形成ATP。生成的ATP共同氧化反应体系中的荧光素分子并发光，荧光信号的有无和强度由CCD照相机记录，再经过计算机分析转换为测序结果，每轮反应后，由三磷酸腺苷双磷酸酶去除剩余的dNTP，再进行下一轮测序反应。下图为图一：工作过程示意图。
图一：454测序技术工作过程图 图片来源：互联网
核心原理是让四种脱氧核苷酸的碱基上分别链接上相应颜色的荧光基团，3’碳上连接阻断基团，封闭3‘羟基，如图二，这使得每次只有一个dNTP能参与DNA的合成，通过在切割位点上断裂，使荧光基团释放，根据荧光基团颜色即可知哪种dNTP结合上去，下一轮测序时只需去除阻断基团即可继续进行DNA合成。
主要流程：把待测序列打断成小片段，两端加接头，利用接头进行桥式PCR（桥式PCR指在微纤维板上固定有许多两种与接头序列互补的小片段DNA，这两种DNA分别对应两端的接头，这些小片段DNA充当着引物的作用，并以待测序列为模板进行DNA合成，如图三），实现扩增待测DNA，保证后续的荧光信号强度足够，接着就是核心原理所说的流程，最后读取荧光信号。
图二：特殊处理后的脱氧核苷酸
图二：特殊处理后的脱氧核苷酸 图片来源：互联网
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