要点：HDR机制在CRISPR/Cas9基因组编辑机制中的定位。
关键词：
CRISPR/Cas9 基因组编辑系统：
https://files.aati-us.com/images/misc/crispr-dual-editing-method.png
发生基因组双链“切割”DNA链的必要条件：
1，CAS9蛋白（复合体）结合DNA序列。
2，sgRNA的一段功能ncRNA“支架”CAS9蛋白（复合体）。
3，sgRNA的一段功能RNA“匹配”DNA单链序列。
发生基因组双链“切割”DNA链的结果事件：
1，CAS9蛋白Ruvc结构域在PAM序列附近特异区产生单链DNA“切割”。
2，CAS9蛋白HNH结构域在sgRNA配对的DNA区产生单链DNA“切割”。
DNA重组修复后基因组DNA链的结果事件：（精细生化背景从略）
1，Knock Out：NHEJ事件发生后，双链断裂并引入Indel。如果是双位点靶向的CAS9体系，可能在重组后靶向位点间的DNA序列极有可能“敲除”。
2，Knock In：如果体系中有外源DNA，而且外源DNA具有和断裂区上下游具有同源区，HDR事件就极有可能发生（同源重组修复），并把外源DNA片段“重组”到切断的基因组DNA双链里。
HDR：Homology directed repair, 重组介导的DNA修复
1，HDR是一种自然产生的核酸修复系统，人类在内的许多生物体的基因组都编码这种系统。(Sander and Joung, 2014)
2，HDR 是由 DNA 中存在双链断裂 (DSB) 而引发的。(Liang et al. 1998)
3，由于CRISPR/Cas9 系统可用于创建有针对性的DNA双链断裂, 研究人员已开始使用 CRISPR/Cas9 来开发人类基因组编辑技术的独特技术。 (Findlay et al. 2014; Mali et al. February 2014; Ran et al. 2013)
4，在非编码RNA（包括sgRNA）引导下，可以对特定的 DNA 位点进行“切割”后，也可以将外源DNA插入目标细胞的基因组。
5，对应供体DNA模板的两侧是被Cas9蛋白复合体切割的同源DNA平端。
6，因此, 细胞的天然DNA修复机制（HDR）可用于：目标DNA序列的插入, 以此高精度编辑方式编辑基因组。
7，CRISPR/Cas9联合HDR可以设计成：“新基因插入”或者“基因敲除”的工具系统。(Mali et al. Feb 2013)
http://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/
结论：HDR效率依赖Cas9或Cas9n复合物的sgRNA靶标情况及基因组DNA切割断裂的形态。
结果阐述：
A：HDR insertion site：HDR插入位点图示：
Cas9n：D10A nickase mutant from S. pyogenes ：第10位氨基酸位点发生天冬酰胺D到丙氨酸A的突变；对功能的改变是只发生单切DNA（Nick）而不发生双切DNA（Cut）。
ssODN：single-stranded oligodeoxynucleotide ：单链寡聚核苷酸。
Human EMX1 locus：人源基因EMX1序列，target21/22位置为Cas9复合物互作位点，红色三角为切割位点。
ssODN HDR模板中12 nt 红色序列为HindIII限制性内切酶位点。目的通过酶切电泳方法鉴定ssODN通过HDR插入靶标基因EMX1内的效率。
B：HindIII酶切验证HEK293FT细胞中HDR插入ssODN的效率。细节从略。
两组31bp 5‘overhang、52bp 5‘overhang为：Cas9n做单切时sgRNA配对切割产生效果分类。
overhang：sgRNA配对靶标DNA形成的结构产生单切后，单链DNA游离的情况。
sgRNA20/21：对应子图A中的target20/21。
两组第一栏（最左）：存在Cas9n，sgRNA20，sgRNA21，ssODN的情况，为两条sgRNA分别单切DNA引发的HDR重组。效率分别为6.5%和9.9%。
两组第五，六栏（最右两）：存在Cas9，ssODN，sgRNA20或sgRNA22 的情况，为单个sgRNA诱导双切DNA引发的HDR重组。第一组效率分别为8.53%和17%；第二组效率分别为8.9%和5.1%。HDR效率与sgRNA的靶标特异性有关。
C：人类胚胎干细胞系HUES62中sgRNA15/17配合Cas9n复合体单切HDR效率：0.4%。单个sgRNA几乎不发生HDR。由于胚胎干细胞染色质的固缩与DNA的不暴露，导致基因编辑效率如此之低。
该实验通过高通量测序计算分析获得。
D：HDR效率依赖Cas9或Cas9n复合物的sgRNA靶标情况及基因组DNA切割断裂形态。
子图左：HDR途径插入ssODN时，产生各种5’overhang的情况图示。
基因EMX1序列上的数值表示为各种sgRNA靶标的位置，对应子图右的效率柱图。
子图右上： '两套sgRNA-Cas9n单切'模式下的HDR效率。5’overhang几乎为HDR高效率的必要条件；两套sgRNA近距离的配对，为HDR高效率的充分条件。
子图右下：Cas9n单切模式与Cas9双切模式作用下HDR效率的比较。在恰当的sgRNA20/21情况下，Cas9双切模式是HDR非常有效率的选择。
材料来源：
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