Dimmer是NGS怼，是NGS癌

对于NGS文库构的构建来说，dimmer有两种：

接头二聚体和引物二聚体。

一、引物二聚体(primer dimmer)

引物二聚体是PCR的副产物。

引物二聚体很难避免。哪怕PCR引物设计得再仔细，上下游引物之间也难免存在局部互补，在退火阶段形成不稳定的临时二聚体。这种不稳定的二聚体在延伸阶段也能被DNA聚合酶延伸，由于延伸形成的新链与模板是完全互补的，临时二聚体越来越稳定，最终形成了稳定的引物二聚体。

尽管以下正命题不一定成立：引物二聚体是由于引物过量造成的。

引物二聚体并不是由于引物单纯过量而造成的。即使引物不过量，很多PCR反应也会产出二聚体。

但是反过来是成立的：PCR引物过量得越多，引物二聚体就越多。

PCR引物的长度一般在30 bp以下（特殊引物也有很长的）。引物二聚体的长度一般在100 bp以下。

在琼脂糖凝胶电泳上，“完美的”PCR可以看到三条带：游离引物；引物二聚体；扩增子。条带越短，弥散越严重。

由于引物二聚体很短，在NGS文库的磁珠纯化过程中，大部分引物二聚体溶解于水相而被去除。只要引物二聚体被去除干净了，就不会影响NGS测序数据。

二、接头二聚体(adaptor dimmer)

接头二聚体是连接反应的副产物。接头二聚体也很难避免。如果说得绝对一点，是不可避免。

NGS文库构建的一个重要步骤是“接头连接”。在被打断且经过末端修补的DNA片段的两端分别加上接头。接头的连接是盲目的，没有选择性，它并不会专门选择基因组DNA片段去连接，而是只要是DNA片段它就能连上去，所以连接产物中有大量由两个接头直接相连、之间没有插入片段的串联接头。

如果你使用的是Illumina TruSeq基因组DNA文库构建试剂盒，接头二聚体的长度是123 bp。虽然比引物二聚体长一点，但是在NGS文库的磁珠纯化过程中也能很好地溶解于水相，被去除干净。

所以，NGS文库建设完成，一定要纯化一下。纯化完成，一定要走个胶，看一看有没有接头二聚体和引物二聚体残留。如果有，那就再纯化、再走胶，直到没有为止。

三、Dimmer怼

对于NGS文库来说，引物二聚体和接头二聚体在碱基序列上是局部重叠的，接头的5‘端就是引物，接头包括完整的引物，引物被完整地包括于接头。

如果文库不纯化，以及纯化不干净，文库中残留有任何二聚体，就会出现“怼”的效果。

怼一、二聚体形成“伪簇”，浪费测序费用。

引物二聚体和接头二聚体的局部序列都能与FC上的接头序列互补，都可以通过桥式PCR形成簇（cluster）。这样的“伪簇”不含有来源于基因组DNA的插入序列，直接测序引物或者接头，而引物和接头都是人工设计的，对于基因组测序来说是无用的序列。

这效果就等于，你花了大约100元/Gb的代价，把引物和接头测序了几百万、几千万、上亿次。一个字，壕！

怼二、“伪簇”是癌簇，浪费大量测序费用。

簇的形成通过桥式PCR。

桥式PCR也是PCR。PCR的基本特性就是：模板越短，PCR扩增效率越高，形成的产物越多。短片段相对于长片段具有竞争优势。

如果NGS文库不纯化干净，残留有各种二聚体，在cluster的形成过程中，二聚体具有先天竞争优势，会压制正常文库，形成更多的簇。二聚体就像FC上的癌细胞一样。

这会导致正常簇的产量，亦即有效测序数据的产量，进一步偏离，大幅度低于预期，浪费更多的测序费用。

怼三、二聚体导致read局部碱基不平衡，降低整张FC数据质量

引物二聚体和接头二聚体的碱基序列都是固定的、一模一样的。在二聚体与插入片段同时被测序的情况下，二者叠加在一起，导致每个read的5‘端30或者70个碱基的碱基复杂度下降，该区域NGS数据分析的base-calling质量下降。

由于NGS数据分析的标准流程是选择每个read前端26个碱基作为代表，代表该read的整体质量。read前端数据质量下降，影响的不是该区域本身，而是整张FC上所有数据的识别质量。

Dimmer是怼，dimmer是癌。

只有纯化干净，才能春暖花开。