据不完全统计，全球有7000多种罕见病，其中80%的罕见病是单基因遗传病。罕见病的疾病总数在临床基因治疗实验适应症分析中占了总体疾病类型8.7%。但由于其本身的发病率极低，单一病症的患者少，且在某些情况下，显性基因性状表达极其轻微，甚至临床不能查出，导致罕见病的发现、研究与治疗变得较为困难，其中广为我们所知的单基因疾病，就有诸如：唐氏综合症，软骨症，血友病A等。
数据来源：J Gene Med 、浙商证券研究所
01
普遍的单基因疾病治疗方法
虽然单基因疾病难以预防医治，但是我们在单基因疾病的治疗方面也并非束手无策。
对于多种累及神经系统的代谢性遗传病，如苯丙酮尿症、枫糖尿症、胱氨酸尿症等，一般采用饮食治疗。通过按不同疾病制定不同食谱,限制底物或前驱物的摄人量,如苯丙酮尿症患儿需食用特殊配制的低或无苯丙氨酸奶粉,尽量减少苯丙氨酸摄入,肝豆状核变性患者采取低锕饮食减少铜的摄人以尽量减少铜在机体的沉积。
对于一些由基因突变导致器官畸形的疾病，则采用手术治疗，如球形红细胞增多症，由于遗传缺陷使患者的红细胞膜渗透脆性明显增高，红细胞呈球形，这种红细胞在通过脾脏的脾窦时极易被破坏而引起溶血性贫血，则可以实施脾切除术，脾切除后虽然不能改变红细胞的异常形态，但却可以延长红细胞的寿命，获得治疗效果。对于多指、兔唇及外生殖器畸形等，同样可通过手术矫治。
对于一些由于体内激素失调的病变，则会使用药物治疗。从而改善患者的病情，减少痛苦。主要是对症治疗，如服止痛剂以减轻病员疼痛。还可以改善机体代谢，如肝豆状核变性，主要是体内铜代谢障碍，使血内铜的水平升高，导致胎儿畸形。可以服用促进铜排泄的药物，同时限制食用含铜的食物，以保持体内铜的正常水平，而达到良好的治疗效果。还有些病如先天性低免疫球蛋白血症，可以注射免疫球蛋白制剂，以达到治疗的目的。
但是这些方法对于单基因疾病的治疗，都只是治标不治本，按照现今的技术唯有基因编辑才能用于从根本上治疗单基因疾病。
02
DNA的构成及DNA与单基因疾病的联系
图源：《杨辉博士采访稿》
众所周知，基因就是有遗传效应的DNA片段。人类的DNA由31亿多个碱基对组成，这31亿多个碱基对则是由ATCG4种碱基有机地排列组合组成。
每个人体内含有20000到25000个基因，虽然由于遗传体系的不同，导致大家各有不同，但就算我们在人群中任意找出两个人对比他们的基因，我们都会发现这俩者间基因的差别微乎其微，只有不足1%的差别。而若是将这俩者的基因与黑猩猩相比较，我们会惊讶的发现，在基因组上黑猩猩与人类的差距也仅在1%多一些，可见微小的差距也会导致基因所表达的性状大有不同。
而单基因疾病的发生则是由于一个碱基的变化，一个碱基完全可以导致基因功能的改变或者缺失而形成疾病。而几乎有50%的单基因的遗传病，都是由于一个碱基变化导致的。
所以，无数代科学家就在考虑一个问题——是否能把这个变异的碱基进行修正？但实际，这样的研究是很难的。
03
基因编辑过程中遇到的问题
图源：《杨辉博士采访稿》
首先，最大的难点在于如何找到这个变异的碱基？人类的身体中含有20000-25000个基因，而构成这些基因的碱基数则更多，有将近31亿。如何精准的将错误的碱基精准的选取出来，成为基因编辑过程中第一个难坎。
紧接着，科学家们在找到对应变异碱基后，如何保证在剪切的过程中不破坏或者改变其他基因，而引发不良后果？
最后，则是如何在修复步骤中，获取那个正确的模板？获取后，又如何通过该模板对基因进行修复？这成为了难倒科学家们的最后一大问题。
04
基因编辑的发展历史
图源：网络
基因编辑技术的研发起源于上世纪70年代，那时试管婴儿刚刚兴起，MIT的Rudolf Jaenisch受其启发，通过直接改变小鼠的受精卵，来观察成体小鼠是否会携带这个基因的突变。
他将病毒的DNA直接注射到受精卵中，然后移入到小鼠妈妈体内。过了三周之后他获得了小鼠，进行基因鉴定，他发现确实所有小鼠的细胞都带有这个病毒的DNA，而且这个DNA具有遗传性，小鼠的后代也都带有这个DNA。
遗憾的是，Rudolf Jaenisc的小鼠实验中，病毒插入到基因组的方式是一个随机插入，而不是定点插入。由于随机插入有可能造成伤害，很难达到最好的效果。因此，严格意义上来说，这次小鼠实验虽然不算失败，但也不足以算基因编辑。
胚胎操作
图源：《杨辉博士采访稿》
但也正是从Rudolf Jaenisc这一次尝试开始，基因编辑的研究走上了正途。
十几年之后，美国科学家马里奥·卡佩奇（MarioCapecchi－盐湖城犹他大学）和奥利弗·史密斯（Oliver Smithies—美国北卡罗莱纳州大学）和英国马丁·埃文斯（Martin Evans—英国加的夫大学）真正实现了定点插入式的基因编辑，他们也因此分别获得了2007年的诺贝尔生理学或医学奖。
在那之后的20多年，基因编辑技术实现了真正的发展，到2012年已经发展到第三代，在CRISPR-Cas9的技术产生后，基因编辑才能称得上是每个实验室都可以操作的技术。
图源：Mazhar Adil,NATURE COMMUNICATIONS,2018
在CRISPR/Cas9自问世以来，其脱靶风险就一直备受科研人员的关注，因为如果将CRISPR/Cas9及其衍生工具用于临床的话，脱靶效应可能会引起包括癌症在内的很多种副作用。
为了减少CRISPR/Cas9的脱靶效应带来的副作用，目前医学界能做的就是提升检测脱靶效应的精度，就在大家因为脱靶检测技术精度不够，而在CRISPR/Cas9的临床使用上极为小心谨慎时，2019年3月1日，一篇题为“Cytosine base editor generates substantialoff-target single-nucleotide variants in mouse embryos”的研究论文在Science发表。紧接着2019年6月10日，Nature又在线发表了一篇题为“Off-target RNA mutation induced by DNA baseediting and its elimination by mutagenesis”的研究论文。一时间，这两篇论文在CRISPR/Cas9的脱靶检测领域一石激起千层浪。
那么，这两篇高质量的研究论文到底出自何方神圣呢？我国中科院神经科学研究所的杨辉研究员以及他的团队走入了公众的视线。
05
研究来自年轻的中国科学家
图源：网络
杨辉研究员，1985年8月生，博士，研究员。
现任中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所灵长类疾病模型研究组组长。2003-2007年就读于上海交通大学生命科学学院，获生物技术学士学位。
2007-2012年就读于中科院上海分院生化细胞所李劲松研究组，获发育生物学博士学位。
2012-2013年在麻省理工Whitehead研究所 Rudolf Jaenisch 研究组从事博士后研究工作。
2014年，回国后任中科院神经科学研究所研究员和灵长类疾病模型研究组组长。
他的研究兴趣主要在于基因编辑技术的基础及应用研究，近年来他的课题组在CRISPR构建基因修饰动物、CRISPR介导的基因治疗以及CRISPR的应用拓展等方面取得了突出成绩。
他的研究成果先后刊发在Cell、Nature、NatureNeuroscience、Developmental Cell、Cell Research等国际顶尖学术刊物上，论文被引3000余次。
杨辉研究员是国家青千入选者、国家优秀青年科学基金项目、上海市青年拔尖人才计划等获得者，现任国家重点研发专项“细胞编程与重编程异常致配子/胚胎源性疾病的分子机制”课题负责人，中国科学院战略性先导科技专项、科技部863项目、上海市科学技术委员会“非人灵长类新型基因编辑技术与脑疾病动物模型”课题骨干。
06
“GOTI”脱靶检测技术的诞生
杨辉博士是中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）最年轻的研究员，但其实他并不满足于当下的状态，杨辉研究员和他的团队开始了对于提高脱靶检测技术精度的研究。
为了提高检测脱靶效应的精度，在实验设计中，杨辉团队设立下了以下要求：
1、通过极为严格的对照组来确定基因突变的位点;
2、为了检测不依赖于sgRNA的随机突变，使用基于单细胞全基因组测序。
实验中，研究组与合作者建立了一种名叫“GOTI”的脱靶检测技术——在小鼠受精卵分裂到二细胞期的时候，编辑一个卵裂球，并使用红色荧光蛋白将其标记。当小鼠胚胎发育到14.5天时，将整个小鼠胚胎消化成为单细胞，利用流式细胞分选技术基于红色荧光蛋白，分选出基因编辑细胞和没有基因编辑细胞，再进行全基因组测序比较两组差异。这样不仅避免了单细胞体外扩增带来的噪音问题，同时由于实验组和对照组来自同一枚受精卵，理论上基因背景完全一致，因此直接比对两组细胞的基因组，差异性就基本可以认定为是基因编辑工具造成的。
杨辉团队还通过引入突变的方法，对两种DNA单碱基编辑器的胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶分别进行了优化，最终获得了3种高保真度的BE3突变体，均能够完全消除RNA脱靶并维持DNA编辑活性的高精度单碱基编辑工具。与此同时，针对ABE系统，杨辉团队也根据降低脱氨酶TadA*的RNA结合活性思路进行点突，在降低RNA脱靶现象的同时，维持了其在DNA上的编辑活性。
图源：NATURE
此外，杨辉团队开发的ABE（F148A）突变体还能够缩小基因编辑窗口，协助实现更加精准的DNA编辑，该项技术在特异性和精确性上超越了ABE7.10。据了解，该突变体有望在未来成为一种更加安全、更加精准的基因编辑工具，并完全应用到临床治疗中。
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