自古真情留不住,唯有套路得人心。前一秒还你侬我侬的蛋白们,转眼就跟 DNA、RNA 甜甜蜜蜜。如何才能守住蛋白之间纯纯的爱情,本期就让我们一起进入免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CoIP)的世界。
CoIP :实验原理
要守护爱情,先了解如何相处,一切从 CoIP 的原理谈起:免疫共沉淀是一种以抗体和抗原识别专一性为基础,用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
图片来源:赛默飞
从原理示意图可见,免疫共沉淀利用抗原 (红三角) 与蛋白 (蓝圆柱) 的特异性结合,再通过连接着树脂的抗体 (紫圆球) 去识别抗原,从细胞裂解液或者蛋白混合物中捕获与抗原相作的蛋白。
之后通过进一步洗脱,获取抗原-蛋白复合物,再对蛋白进行检测(Western Blot 或者 Mass spectra),即可获得蛋白间相互作用的信息。
实验步骤
了解了原理,再来看看操作,简单来说,可以总结为以下四个部分:
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第一步:样品制备
首先进行样品制备,以提取出想要研究的蛋白,由于不同类型的细胞裂解条件有所差异,这里不展开介绍。
细胞裂解要采用温和的裂解条件,避免破坏细胞内存在的蛋白间相互作用,裂解、洗涤时需使用非变性裂解液,如 NP-40 和 Triton X-100。
此外,由于不同细胞裂解条件不一样,建议通过预实验来确定最佳条件。
第二步:固定抗体
在共沉淀之前,先将固相基质与抗体共同孵育,从而使两者结合,常用的固相基质有琼脂糖 Agarose 和磁珠 Magnetic beads。
琼脂糖 Agarose 具有简单易用,直径大,结合力强,多孔易吸附的特点;
磁珠具有直径小,背景低,抗体消耗少的特点,但操作时需借助磁力架。
抗体的选择十分重要,选经过 IP 验证的抗体,可以减少假阳性概率。
同时,要注意抗体/缓冲液的比例,抗体稀释过度不利于后续抗原抗体结合;而抗体过多就不能完全沉降在固相基质上,残存于上清。
操作时,为了避免损伤 beads,使用大口径或截短枪头进行加样。
第三步:免疫共沉淀
根据不同的抗体结合方式,这里的免疫共沉淀步骤会稍有不同,但是本质是一样的,都是为了形成抗原-蛋白复合物。
如果直接使用 Protein A/G 结合的 beads,先进行细胞裂解液/蛋白混合物与抗体的孵育,再加入 beads 将蛋白-抗体复合物拉下来。
如果使用了交联剂将抗体与 Protein A/G 固定,或者直接将抗体固定在 beads,则将固定抗体的 beads 与细胞裂解液或则蛋白混合物一起孵育。
增加在洗脱之前的洗涤次数或在免疫共沉淀缓冲液中加入 Triton X-100 ,可以降低非特异性结合,以防止蛋白在阴性对照树脂实验样品中被检测到。
第四步:洗脱与检测
最后一步则是使用洗脱缓冲液将互作蛋白复合物洗脱,并通过 Western Blot 或者 Mass spectra 检测鉴定蛋白。当蛋白或抗体对低 pH 的缓冲液敏感,可使用中性 pH 值的洗脱缓冲液。(
赛默飞温和洗脱缓冲液,产品编号:21027)如后续需进行酶活或功能性分析,则需使用兼容下游检测的 Elution buffer 进行洗脱。
对于交联剂结合的 beads,为了保持抗体偶联树脂的活性,应立即再生和存储树脂,保证抗体可以重复利用。
当然,CoIP 过程中还有许多常见问题和注意事项,使用赛默飞免疫共沉淀试剂盒,可以帮您免去不少试剂耗材的选择问题
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图片来源:赛默飞、创客贴
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