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经典的m6A RNA甲基化研究案例
生物_医药_科研
>《待分类》
2019.08.18
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文章标题:
METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma
发表杂志:
Molecular Cancer
影响因子:
10.679
发表时间:
2019
年
6
月
中山大学肿瘤防治中心徐瑞华教授和鞠怀强教授团队在结直肠癌(
CRC
)中发现
METTL3
能够基于
m6A-IGF2BP2
的机制促进肿瘤进展。
鉴于结直肠癌中并未有太多关于m6A RNA
甲基化修饰的报道,本研究首次在结直肠中证实了
METTL3
促癌的功能。
主要研究结果
1. METTL3
在转移性
CRC
中高表达且与不良预后相关
首先在
TCGA
数据库中发现多个
m6A
相关‘写蛋白
/
擦除蛋白
/
读蛋白’的表达水平在结肠癌中异常表达
(Fig.1a)
,
qPCR
验证了其表达水平
(Fig.1b)
。
由于METTL3
在多个癌种中被证实高表达,进一步验证发现
METTL3
在复发性
CRC
组织和转移性肝组织也呈现表达上调
(Fig.1c)
,而且
mRNA
和蛋白水平在
CRC
细胞系也显示上调
(Fig.1d-e)
。
METTL3
蛋白水平在
CRC
患者中表达上调
(Fig.1f)
,免疫组化结果验证了
METTL3
在
CRC
组织、淋巴结和肝转移组织中都显示出高表达
(Fig.1g-h)
。
更重要的是,METTL3
高表达的患者化疗效果更差
(Fig.1i)
,整体生存率和无病生存率更低
(Fig.1j)
。
2. SOX2
受
METTL3
介导的
m6A
修饰调控
METTL3
在
SW620
细胞中显示比
SW480
中具有更高的表达(两种细胞系具有不同的转移潜能,
Fig.2a
),然后利用
MeRIP-seq
和
RNA-seq
在
SW480
、
SW620
和
METTL3
敲降的
SW620
细胞中寻找潜在的靶点。
综合分析差异的甲基化peak
和表达水平,发现与
SW480
细胞相比,
SW620
细胞中
733
个高甲基化
peak
同时具有更高的表达水平;
在敲降的细胞中3393
个低甲基化
peak
具有更低的表达水平
(Fig.2b)
。
从这两组结果中发现192
个特异性的
peak
被共享
(Fig.2c)
,与
158
个基因相关,通路富集发现这些可能参与干细胞分化的通路中
(Fig.2d)
。
进一步对候选的基因分析发现四个基因
SEMA3A
、
BCHE
、
ZFP36L2
和
SOX2
在
SW620
细胞中显示出
m6A
修饰的大幅增加,而在敲降细胞中显示一致的减少
(Fig.2e)
。
然而m6A-qPCR
实验证实
SOX2
的
m6A
水平在敲降细胞中下降得最显著,因此
SOX2
可能作为
METTL3
的潜在靶点参与到促进
CRC
干性和转移过程中
(Fig.2f-h)
。
3.
体外实验证实
METTL3
促进
CRC
细胞干性
在
METTL3
敲降的
SW620
细胞中球体数目
(Fig.3a-b)
、菌落形成、侵袭能力均受影响
(Fig.3c)
,而对奥沙利铂的化疗敏感性增加
(Fig.3d)
,癌症干细胞表面抗原
CD133
、
CD44
和
EpCAM
在
METTL3
被抑制后显著下降
(Fig.3e)
,同时
METTL3
下游基因也被显著抑制
(Fig.3f)
,另外
SOX2
过表达能够
rescue
干性下降的表型
(Fig.3g-i)
。
这些结果表明METTL3
在
CRC
细胞中的致癌的角色,主要通过维持
SOX2
的表达实现促进肿瘤的自我更新、细胞侵入和化疗抗性。
4.
体内实验证实
METTL3
驱动
CRC
肿瘤发生和转移
通过异种移植实验发现
METTL3
敲降的细胞移植后肿瘤生长速率下降、肿瘤体积减小
(Fig.4a-b)
;
免疫组化发现尾静脉注射对照组
SW620
细胞的小鼠会出现更多的肺转移结节
(Fig.4c)
。
同样地,
SOX2
过表达能够
rescue
肿瘤形成的功能
(Fig.4d)
。
利用
PDX
模型瘤内注射
siRNA
评价
METTL3
的治疗作用,主要结果也与上述一致
(Fig.4e-h)
。
因此,体内实验确实证实了
METTL3
在
CRC
中的成瘤和转移作用。
5. IGF2BP2
基于
m6A
修饰的方式增加
SOX2 mRNA
稳定性
先前有研究发现两类
m6A
读蛋白(
readers
)家族可能控制着甲基化修饰的
mRNA
的命运,如
YTH
家族和
IGF2BP
家族。
为了揭示SOX2
特定的
m6A readers
,利用链霉亲和素
RNA pull down
实验检测相关的
readers
,发现
IGF2BP2
特异性地结合在
SOX2
全长转录本上,而非
IGF2BP
家族其它成员或
YTH
家族
(Fig.5a)
。
而且pull down
实验也证实了
IGF2BP2
主要结合在
CDS
区,在
motif
缺失后特定的结合也会受到影响
(Fig.5b)
。
RIP
实验同样地证实了
IGF2BP2
和
SOX2 mRNA
之间直接的影响
(Fig.5c)
。
在抑制
IGF2BP2
后
SOX2
蛋白和
mRNA
水平、
SOX2
下游基因表达水平均受到显著抑制,
IGF2BP2
和
SOX2
转录本之间的作用也会受到
METTL3
的影响
(Fig.5d-h)
。
在抑制METTL3
或
IGF2BP2
后,
SOX2 mRNA
表达水平开始下降,而且其半衰期显著变短
(Fig.5i-j)
。
这些结果都能说明IGF2BP2
确实充当
reader
的角色,维持
SOX2
转录本的稳定性。
6. METTL3/SOX2/ IGF2BP2
在
CRC
中的临床相关性
基于以上机制的发现,利用临床样本分析
METTL3/SOX2/IGF2BP2
之间的相关性,包括免疫组化实验、表达相关性,利用三个
marker
的
IHC
数据对
CRC
患者进行预后的预测,三者的高表达显示了最差的预后,因此可以建立一个很好的预测模型
(Fig.6)
。
研究总结
本研究发现了
METTL3
对于
CRC
进展的关键作用及可能基于
m6A
的机制,
METTL3-IGF2BP2-SOX2
之间的调控作用是基于
m6A
这一表观调控机制来实现的,另外
PDX
模型显示
METTL3
作为潜在靶点可能具有一定的治疗作用。
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