m⁶A通过调节组蛋白甲基转移酶Ezh2调控神经形成和神经元发育

N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰是真核细胞中最丰富的RNA修饰，参与了RNA的翻译、降解、亚细胞定位、选择性剪接和等多种生物学过程。近年来，人们发现m⁶A在哺乳动物神经系统的mRNA中普遍存在，并在胚胎期和产后神经元发育过程中表现出动态特征。浙江大学医学院李学坤教授团队在今年4月发表的最新研究“m⁶A Regulates Neurogenesis and Neuronal Development by Modulating Histone Methyltransferase Ezh2”揭示了m⁶A甲基化修饰在神经元发育和成体神经形成中的作用。

研究结果

1、在sNSC（成体神经干细胞）分化过程中，Mettl3和m⁶A的表达呈现动态变化

研究者从成年野生型小鼠的前脑中分离出aNSCs（成体神经干细胞），发现在aNSC分化过程中，Mettl3和Mettl14的表达显著升高。RNA斑点免疫印迹法检测发现m⁶A的水平，增殖分化的过程中也显著升高。（图1）

图1

2、Mettl3在神经元的发育过程中的功能

为了研究Mettl3在aNSCs增殖分化中的功能，研究者采用慢病毒转染shRNA敲低小鼠aNSC中的Mettl3。发现敲低Mettl3显著降低了整体的m6A水平，且aNSCs增殖受到抑制。（图2）

图2

另外，敲低Mettl3抑制了aNSC细胞的增殖，并且导致细胞周期失调，但不影响aNSC的同质性（图3）。

图3

接下来，研究者发现敲低Mettl3减少Tuj1+神经元细胞的数量，且其细胞标志物的启动子活性也降低了，而对GFAP+胶质细胞的数量和标志物的启动子活性影响相反。而且敲低Mettl3后，新生神经元的树突分支数和树突总长度均明显减少，Mettl3过表达的情况则恰好相反。体外实验观察到了同样的现象。综合以上结果表明，Mettl3在调节aNSC细胞分化的过程中存在谱系定向，偏向于调节神经元的分化，并且在体内和体外都能促进神经元的发育。

3、m⁶A修饰转录产物参与神经形成和神经元发

为了系统阐明m⁶A在神经形成和神经元发育中的作用，研究者采用MeRIP-Seq结合RNA测序，探讨m⁶A在aNSCs细胞增殖样本和细胞分化样本中的基因表达和甲基化情况。MeRIP-Seq结果显示有6569种基因在两组样本间重叠，GO功能分析发现这些重叠基因的功能主要与转录、神经形成、神经元分化和细胞周期有关。在细胞增殖样本特异性表达的基因在DNA复制、细胞周期中富集，而在细胞分化样本特异性表达的基因在神经形成、神经元发育分化方面富集。结合RNA测序结果，发现表达变化并发生m⁶A修饰的基因也在细胞周期、神经系统发育和神经元分化相关的通路中富集。这些数据表明m⁶A修饰在调控aNSCs基因表达中起着关键作用（图4）。

图4

通过MeRIP-Seq结合RNA测序比较对照组和Mettl3敲低组的aNSC中基因的表达和m⁶A修饰分布模式。GO功能富集分析和IGV图像表明，m6A修饰的上调基因主要与神经元分化、神经形成和神经系统发育有关；m⁶A标记下调的基因主要参与神经发育（Vegfa、syt4）和细胞增殖（Tet1、E2f7）（图5）。

图5

4、Ezh2可以修复Mettl3缺失引起的神经形成和神经元发育缺陷

之前有研究表明，组蛋白甲基转移酶Ezh2在神经形成和神经元发育中发挥了重要的作用。因此研究者在Mettl3缺失的aNSCs中过表达Ezh2，结果增加了BrdU+细胞的数量，促进了神经元分化，新生神经元的树突数量和长度也随之增加。综上所述，Ezh2过表达可以挽救Mettl3缺失所引起的神经形成和神经元发育缺陷。

全文总结

1、Mettl3缺失显著降低aNSC的m⁶A水平，抑制了aNSC的增殖；

2、Mettl3缺失抑制神经元的发育，使神经干细胞向神经胶质谱系分化，影响成年脑新生神经元的形态成熟；

3、MeRIP-Seq显示，m⁶A主要富集于与神经形成和神经元发育相关的转录本；

4、Ezh2过表达可以修复Mettl3缺失引起的神经形成和神经元发育缺陷。

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