Cell | 利用新型肠道上皮细胞培养方法探索肠道炎症损伤与修复机制

肠道上皮细胞是隔离肠道内容物和下层组织的物理屏障。在遭受感染、损伤时这层肠道上皮细胞受损，肠道通透性增加。破坏程度较轻时，周边的上皮细胞迁移到损伤处并促进伤口愈合。在炎性肠病IBD（Inflammatory bowel disease）中，损伤反复出现，伤及隐窝结构，肠道干细胞则会迁移至伤口处，更新肠道上皮细胞【1】。探索肠道上皮修复的关键问题是找到肠道干细胞群。在组织保持稳态时，两群肠道干细胞维持肠道上皮更新：第一种是Lgr5阳性的快速循环的隐窝基底柱状细胞；第二种是Hopx、Lrig1、Tert 和Bmi1（+4）阳性的慢循环干细胞。在辐照损伤的小鼠小肠中Lgr5+细胞对上皮修复是必需的。然而在结肠发生炎症Lgr5+细胞对上皮修复则是可有可无的。有报道称在右旋糖酐硫酸钠（DSS）引起的结肠炎和蠕虫感染中肠道上皮细胞会发生逆转，转变为胎儿样肠道上皮干细胞，促进组织修复【2】。由于缺少细胞追踪和细胞剔除的实验方法，尚未鉴定出在结肠发生炎症时发挥关键修复作用的肠道干细胞。目前的成球或者类器官培养方法是用来模拟在稳态时的肠道上皮的再生和更新，但不能模拟损伤状态的下的肠道上皮的修复，并且体外培养时寿命太短。在IBD发生时，上皮细胞会处在缺氧和内质网应激状态中，并且不停的转换细胞状态以达到修复目的【3】。目前尚无体外培养方法能够模拟这样一个复杂的过程。

2019年11月7日，来自美国华盛顿大学的Thaddeus S. Stappenbeck课题组在Cell发表了题为Long-Term Culture Captures Injury-Repair Cycles of Colonic Stem Cells的文章。该研究发现了肠炎相关再生的干细胞群。此外作者还建立了能够长期体外2D培养的方法，来模拟肠道损伤中隐窝修复的细胞循环。

作者首先用DSS喂食小鼠7天诱导IBD，之后再喂水14天。观察发现前七天时，炎症处以及炎症周围的隐窝处的细胞发生萎缩，呈方形，而在恢复期的14天中，隐窝处的细胞则呈现出肥大状，为柱状。染色后发现14天的恢复期中Lgr5的表达水平一直受到抑制，而Hopx的表达在隐窝的肥大细胞中明显的上升。接下来作者用Hopx-CreERT2/Rosa-LSL-tdTomato (Hopx^CreER/Rosa^Td) 和Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2/Rosa-LSLtdTomato (Lgr5^CreER/Rosa^Td)来验证Hopx在肥大的隐窝细胞中高表达。作者在观察tdTomato荧光时同时染了一个胎儿时期肠道干细胞的标志物Trop2发现，有超过70%的Trop2+细胞表达Hopx。用白喉毒素行细胞剔除实验证明了Hopx阳性的细胞促进肠道修复。作者把这类细胞称为Hopx⁺ CARSCs colitis-associated regenerative stem cell (CARSC) 。

作者建立了一个气液界面的培养条件使得隐窝细胞能够在2D的环境中长时间的存活，染色证实培养的细胞中存在多种类型的肠道上皮细胞。RNA-seq对比发现气液界面培养的第一天的细胞的表达谱与DSS诱导的IBD模型中的肠上皮细胞恢复期的表达谱类似。再重新将细胞浸没到培养基24小时能够降低细胞中Hopx的表达，类似于DSS诱导的肠炎中肠道隐窝处的萎缩的细胞中Hopx的表达丢失。以此循环的在浸没和气液交界面培养细胞能够模拟体内肠上皮损伤后再生的循环过程。利用RNA-seq进一步分析发现低氧诱导的HIF1信号，以及低氧导致的糖酵解和内质网应激都会因为细胞从气液界面培养转到浸没培养而升高。用低氧或者常氧环境培养气液交界面的细胞也能够模拟上皮细胞从损伤到修复再生的转变。染色实验也证实在隐窝萎缩的细胞中HIF1的表达明显高于柱状的肥大隐窝细胞。这些都表明氧张力可能是隐窝细胞在损伤和修复状态转换的关键因素。

除了氧张力外，还有多种因素，例如免疫细胞以及成纤维细胞也会影响隐窝干细胞的修复作用。利用作者开发的这种长期2D培养肠道隐窝细胞的方法或许能够更好的研究隐窝细胞的修复再生机制。