☆一、BRAF基因突变概述
◇ BRAF基因的生物学意义是什么？
BRAF基因位于人类7号染色体上，7q34，负责编码一个传递细胞信号的RAF激酶蛋白。RAF激酶蛋白属于RAS-RAF-MEK-ERK信号通路（即MAPK/ERK通路）的一部分，主要功能是将细胞表面的受体通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，激活多种因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。在绝大多数组织和细胞类型中，BRAF是MEK/ERK最为关键的激活因子。BRAF基因属于致癌基因，当其发生致病性突变时，可能致使正常细胞转变为癌细胞。
◇ BRAF基因所参与的信号通路是什么？
BRAF属于EGFR下游MAPK通路，此通路的激活会导致信号持续放大,诱导肿瘤细胞增殖并逃避凋亡,因此抑制这一通路的活性己成为抗肿瘤药物研发的新热点。通路中的主要成员包括RAS、RAF、MEK和ERK蛋白。BRAF编码的蛋白-RAF激酶，是MAPK/ERK通路中的主要调节者之一，RAF激酶能通过磷酸化作用来激活其下游的MEK。MAPK/ERK信号通路能调节细胞的生长、增殖、分化、迁移和凋亡。BRAF突变是不少恶性肿瘤的常见发病原理。在正常情况下，RAF蛋白会根据其所收到的信号来控制下游信号通路的活动与细胞生长。当BRAF发生致病性突变时，可导致RAF蛋白处于持续激活状态，在未接收到化学信号时也持续对其下游通路传导信号，导致细胞不受控制地生长与增殖。
◇ BRAF突变在恶性肿瘤中的发生率是多少？
BRAF突变在肿瘤中很常见，见下表。
表1
BRAF突变在恶性肿瘤中的发生率
恶性肿瘤
发生率
黑色素瘤
40-50%
甲状腺癌
10-70%（取决于组织学类型）
结直肠癌
10%
NSCLC
3-5%
◇ BRAF突变主要有几种类型？
在人类肿瘤中已经鉴定出大约200个BRAF突变等位基因，分3种不同的类别：
△ I类突变：V600突变激酶激活性单体，常见BRAF V600D/E/K/R突变，导致强烈激活BRAF激酶活性，对BRAF和MEK抑制剂敏感。
△ II类突变：激酶激活性二聚体，包括BRAF K601，L597，G464和G469突变，这些基因突变位于活化片段或位点，是RAS非依赖性二聚体。Ⅱ类突变，可能不会从EGFR靶向药物治疗中获益。
△ III类突变：激酶失活性异源二聚体，包括BRAF G466，N581，D594和D596突变，这些基因突变位于结合位点折叠的催化环或DGF基序，激酶活性低于野生型BRAF或缺乏激酶活性。Ⅲ类突变，可能从EGFR靶向药物治疗中获益。
◇ 第3类BRAF突变
BRAF已经发现了200多个突变位点。两篇Nature论文发现了第3类BRAF突变，即没有激酶活性的BRAF突变，这种突变的蛋白比野生型的BRAF与RAS激活体（RAS-GTP）的结合能力更强，从而组装成激活二聚体，使ERK重新激活，进而诱发肺腺癌的发生。相比于野生型 BRAF，没有激酶活性的BRAF突变体与激活形式的RAS结合能力更强。第3类BRAF突变对ERK负反馈敏感，并且它们的激活是RAS依赖的，相当于反过来激活了RAS。这些突变比野生型 BRAF更强结合到RAS-GTP上，进一步加强CRAF，导致ERK通路增加。和这个发现一致的临床发现，带有这类BRAF突变的黑色素瘤一般有RAS突变或NF1缺失，从而BRAF和RAS两个都出问题从而发生癌症。
◇ 关于第3类BRAF突变【1】
第3类BRAF突变，是激酶活性受损或激酶死亡的突变。这些突变对ERK介导的反馈敏感，其信号激活是RAS依赖性的。这些突变与RAS-GTP（激活状态的RAS）的结合比野生型BRAF更紧密，它们与野生型CRAF的结合和激活更强，导致ERK信号传导增强。这些突变在肿瘤中引起的信号传导失调需要共存的机制来维持RAS激活，尽管需要ERK依赖的反馈。与这一假设一致，具有这些3类BRAF突变的黑色素瘤也有RAS突变或NF1缺失。相比之下，在具有3类BRAF突变的肺癌和结直肠癌中，RAS通常被受体酪氨酸激酶信号激活。这些肿瘤对受体酪氨酸激酶抑制剂抑制RAS活化敏感。因此，我们在人类肿瘤中定义了三类不同功能的BRAF突变。突变通过不同的机制激活ERK信号，这些机制决定了它们对该途径的治疗性抑制剂的敏感性。
◇ 什么是KRAS？
KRAS也称为Kirsten鼠类肉瘤病毒基因同源蛋白(V-Ki-ras2)，首次发现于1982年，是在人体内发现的第一个癌基因。1982年，科学家从人膀胱癌细胞系中克隆到了第一个癌基因，并很快确定这个癌基因是KRAS。 KRAS是RAS超家族中的成员。RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种：HRAS、KRAS、NRAS，分别定位在11、12和1号染色体上。在RAS基因中，KRAS对人类癌症影响最大。 其中KRAS突变最为常见，大约占85%。KRAS G12C突变在非小细胞肺癌（NSCLC）中大约占13%，在结直肠癌中大约3%-5%，在其他实体瘤中大约1%-2%。 KRAS编码21kD的ras蛋白，又名p21基因。这种蛋白以两种不同的形式出现，非激活状态下的GDP结合形式和激活状态下的GTP结合形式。KRAS好似一个开关，当与GDP结合时，开关关闭，当GDP变成GTP后，开关就打开，细胞开始繁殖。KRAS基因发生突变时，GTP异常增加，开关持续打开，细胞开始不受控制的繁殖，最终变为肿瘤。
◇ 什么是RAS依赖性？什么是RAS非依赖性？
在EGFR/RAS/RAF/MEK/ERK信号通路中，RAS是BRAF的上游，I类和II类突变激活BRAF激酶活性，不需要依赖RAS的表达激活，即RAS非依赖；III类突变使BRAF丧失激酶活性，需要依赖上游RAS的表达激活，即RAS依赖。通俗理解，以一个正在睡眠的人做比喻，BRAF I类和II类突变，把自己变醒了，不需要RAS来唤醒他，即RAS非依赖；III类突变把自己变昏迷了，原来就在睡眠，现在昏迷了，自己醒不了了，需要别人救他，即需要RAS来救醒他，即RAS依赖。
◇ 肿瘤相关BRAF突变的分类
表2，肿瘤相关BRAF突变的分类
BRAF突变
激酶活性
RAS
依赖
Dimer
依赖
维罗非尼敏感性
I类
野生型
Neutral
是
是
不敏感
V600E
高
否
否
敏感
V600K
高
否
否
敏感
V600D
高
否
否
敏感
V600R
高
否
否
敏感
V600M
中等
否
否
敏感
II类
K601E
高
否
是
不敏感
K601N
高
否
是
不敏感
K601T
高
否
是
不敏感
L597Q
高
否
是
不敏感
L597V
中等
否
是
不敏感
G469A
高
否
是
不敏感
G469V
高
否
是
不敏感
G469R
中等
否
是
不敏感
G464V
中等
否
是
不敏感
G464E
中等
否
是
不敏感
融合
高
否
是
不敏感
III类
D287H
低
是
是
不敏感
V459L
低
是
是
不敏感
G466V
低
是
是
不敏感
G466E
低
是
是
不敏感
◇ EGFR -RAS-RAF-MEK-ERK信号通路靶向药物
表3
EGFR -RAS-RAF-MEK-ERK信号通路靶向药物
西妥昔单抗
靶点：EGFR
帕尼单抗
靶点：EGFR
达拉非尼
靶点：BRAF,LIMK1,RAF,NEK11,S1K1,BRAF V600E
康奈非尼
靶点：BRAF V600E，以及野生型BRAF和CRAF。警告：康奈非尼在BRAF野生型肿瘤中促进细胞增殖。
binimetinib
靶点：MEK1/2
曲美替尼
靶点：MEK1/2，MAPK,MAPKK1,MAPKK2
维罗非尼
靶点：BRAF V600
☆二、BRAF突变与非小细胞肺癌（NSCLC）
◇ BRAF突变-来自2020V2版NSCLC NCCN指南的理念【2】
算法：
BRAF V600E突变
首选方案
达拉非尼+曲美替尼（2A类）
其它推荐方案【ggg】
维罗非尼，或，达拉非尼
在特定情况下有用的方案
见初始系统治疗
【ggg】如果不能耐受达拉非尼+曲美替尼的联合治疗，可以选择单药达拉非尼或维罗非尼。
◇ BRAF V600E 突变（讨论相关内容翻译）
BRAF（v-Raf小鼠肉瘤病毒癌基因同源物B）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是MAP/ERK信号通路的一部分。BRAF V600E是所有肿瘤类型中最常见的BRAF点突变；它发生在1%到2%的肺腺癌患者中。尽管其它BRAF突变发生在NSCLC患者中，其发生率约等于p.V600E（与许多其它肿瘤类型不同），但对于这些其它突变，尚没有特异性靶向治疗。
BRAF V600E基因突变的患者通常是现在或以前的吸烟者，而EGFR基因突变或ALK基因重排的患者通常是不吸烟者。BRAF突变通常与EGFR突变、ALK重排或ROS1重排不重叠。建议对转移性非鳞NSCLC患者进行BRAF突变检测（2A类），并可考虑对肺鳞癌患者进行BRAF突变检测，如果是使用小活检标本评估的组织学或报告为混合性组织学类型。实时PCR、Sanger测序和NGS是评估BRAF突变最常用的方法。NCCN NSCLC小组建议检测BRAF突变，是基于达拉菲尼/曲美替尼对BRAF V600E突变患者疗效的数据，并根据FDA的批准。
对于BRAF V600E突变的患者，推荐采用达拉菲尼/曲美替尼或双药化疗方案进行初始细胞毒性治疗（例如，卡铂/培美曲塞治疗非鳞NSCLC）。如果不能耐受达拉菲尼/曲美替尼的联合治疗，建议使用达拉菲尼或维罗非尼的单药治疗。
◇ FDA批准
2017年6月，美国FDA批准了达拉非尼与曲美替尼联合治疗用于治疗BRAF V600E突变的转移性非小细胞肺癌，总有效率超过 60%，疾病缓解时间长达 12.6 个月。
◇ 解读：
NCCN指南的理念，NSCLC最常见的BRAF突变是BRAF V600E突变，其它的BRAF突变发生率与BRAF V600E突变差不多，但只有BRAF V600E突变有特异性靶向药，其他BRAF突变尚没有特异性靶向药。NCCN指南对BRAF V600E突变的NSCLC，首选的推荐是“双靶联合”，即达拉非尼抑制上游的BRAF V600E突变，曲美替尼抑制下游的MEK。如果患者不能耐受“双靶联合”的副反应，可以单用BRAF抑制剂维罗非尼或达拉非尼，这种情况下，未推荐单用下游的MEK抑制剂曲美替尼。另外，NCCN指南只提及BRAF V600E突变的NSCLC的靶向治疗，未提及除BRAF V600E以外其它BRAF突变的靶向治疗，指南对此的说明是“没有靶向药物”（见前面讨论相关内容）。注意，有NCCN指南以外的文献指出临床上对BRAF V600E突变的肺癌患者，单用药物抑制BRAF V600E，会促进CRAF自聚诱发良性肿瘤。
☆三、BRAF突变与结肠癌【3】
2020V1版结肠癌NCCN指南（发布于2019-12-19）的理念，（P22，COL-B4 OF 8），任何已知的KRAS突变（第2, 3, 4外显子）或NRAS突变（第2, 3, 4外显子）患者不应该使用用西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。BRAF V600 E突变极不可能对帕尼单抗或西妥昔单抗有反应，除非加用BRAF抑制剂。在MLH1缺失的情况下出现BRAF V600E突变，将在绝大多数病例中排除Lynch综合征（LS）的诊断。BRAFV600E突变的存在提示为散发性癌症。然而，约1%有BRAFV600 E突变（和同时有MLH-1的缺失）的癌症是LS。在BRAF V600E突变的情况下，应谨慎地对有强烈家族史的病例进行生殖系筛查排除LS患者。
◇ 解读：
BRAFV600 E突变结肠癌患者属于一个特殊群体，这些患者若不联用BRAF V600 E抑制剂而单纯使用抗EGFR的西妥昔单抗或帕尼单抗则无效，NCCN指南对BRAF V600 E突变结肠癌患者推荐的靶向治疗有两个方案，①达拉非尼+曲美替尼+（西妥昔单抗或帕尼单抗）；②康奈非尼+（西妥昔单抗或帕尼单抗）± binimetinib。这两个方案都是三靶联合，方案①达拉非尼+曲美替尼+（西妥昔单抗或帕尼单抗），BRAF V600E抑制剂达拉非尼+MEK抑制剂曲美替尼+EGFR抑制剂西妥昔单抗或帕尼单抗；方案②康奈非尼+（西妥昔单抗或帕尼单抗）± binimetinib，BRAF抑制剂康奈非尼+ EGFR抑制剂西妥昔单抗或帕尼单抗±MEK抑制剂binimetinib，这两个方案都是纯靶向药方案，使结肠癌在特定情况下达到“去化疗化”。
☆四、BRAF突变与甲状腺癌【4】
◇ BRAF-V600E 有助于甲状腺癌的诊断
2019V2版甲状腺癌NCCN指南的理念，滤泡癌或Hürthle细胞癌的诊断需要有血管或包膜侵犯的证据，这是无法通过细针穿刺确认的。分子学诊断可能有助于根据基因特征将滤泡性病变(例如根据基因谱判断滤泡细胞肿瘤、意义未明的不典型增生[AUS]，意义未明的的滤泡性病变[FLUS]）再分类，分析更可能是或更不可能是良性或恶性病变。如果分子学检测提示为乳头状甲状腺癌，特别是伴有BRAF V600E突变时，参看(PAP-1)。BRAFV600E突变发生在45%的乳头状癌患者中，是最常见的突变。一些研究表明BRAF V600E突变与预后不良有关，尤其是在TERT启动子突变时。肿瘤的某些特征对预后有着深远的影响。最重要的特征是肿瘤组织学、原发肿瘤大小、局部浸润、坏死、血管浸润、BRAF V600E突变状态和转移。
◇ BRAF V600E突变阳性IV期甲状腺未分化癌（ATC）患者治疗：
NCCN指南对BRAF V600E突变阳性IV期ATC患者，首选推荐达拉非尼/曲美替尼联合治疗（指南P52 页）。
◇ 解读：
NCCN指南对甲状腺癌的分类为，乳头状癌，滤泡癌，Hürthle 细胞癌，髓样癌，未分化癌（又称间变性癌ATC，或肉瘤样癌）。在甲状腺癌诊断方面，指南提示若BRAF V600E突变阳性，则有助于甲状腺乳头状癌的诊断。有NCCN指南以外文献指出若检出BRAF V600E突变阳性，就基本可以诊断甲状腺乳头状癌，特异性几乎可以达到100%。在甲状腺癌治疗方面，指南只提及对BRAFV600E突变阳性IV期ATC患者，推荐达拉非尼/曲美替尼联合治疗，未对其它类型甲状腺癌推荐达拉非尼/曲美替尼联合治疗。在手术方面，有文献指出如果治疗前就检测到BRAF-V600突变，说明肿瘤侵袭性比较强，可能合并多个病灶，所以在手术方案的选择上，就倾向于更大范围的手术方案，以保证手术彻底性。预后方面，有文献指出，如果手术后，检测到BRAF-V600E基因突变，说明该肿瘤可能侵袭性比较强，复发转移概率比没有BRAF-V600E基因突变的更高，所以要密切随访观察。
参考文献：
【1】《Nature 2017 Aug10;548(7666):234-238. doi: 10.1038/nature 23291. Epub 2017 Aug 2，Tumours with class 3 BRAF mutants are sensitive to the inhibition of activated RAS.》
【2】2020V2版非小细胞肺癌NCCN指南
【3】2020V1版结肠癌NCCN指南
【4】2019V2版甲状腺癌NCCN指南
