但是，光学成像目前面临一项挑战——设计合成的光学探针标签可能干扰分子靶标的生物活性和识别特性。所以近年来，人们采用多种化学方法，使荧光或拉曼成像标签微小化，以实现生物分子的微创标记，同时保持对荧光和拉曼显微镜的敏感性和兼容性。本文总结了近年来合成微型化学标签（miniaturized chemical tags）的方法及其在生物成像中的一些应用 [1]。
前言图：微型化学标签成像的四个主要靶标
在过去的几十年里，发现的许多荧光分子如荧光素、罗丹明、花青素等是带电结构，其尺寸比细胞中的信使分子还大。这些化学性质会影响代谢物的细胞内定位和生物活性谱，因此应用时往往需要引入适当的间隔物。另外，荧光团更小（200-300 Da）、化学结构更简单的荧光分子破坏性更低（图1）。
最古老的小型荧光团是香豆素，在1868年由Perkin首次合成，具有良好的生物相容性和激发荧光，可用于检测半胱氨酸、谷胱甘肽等物质。最近，Schnermann团队用二氟亚甲基替换香豆素核心的氧原子，产生了发射波长在近红外（NIR）范围的小荧光团。这些染料在疏水环境中表现出较强的发射，可以用于细胞中脂滴的成像[2]。
一种用于生物成像的小型荧光团家族是硝基苯并恶二唑（NBD）。NBD的结构具有高度的通用性，化学结构的微小调整可以改变其光学性质。VanVeller等用氰基取代硝基，获得了具有红移发射波长和对极性变化更高灵敏度的衍生物。SCOTfluors是一个具有可变桥接单元的小型荧光团家族，发射波长从可见光谱的蓝色到近红外区域。该化学平台能够对葡萄糖、乳酸、神经酰胺等代谢物进行多色标记和活细胞跟踪。
另一类新兴的小型荧光团是单苯环碳环。最近发现，氨基萘和蓝烯等全碳环荧光分子可作为细胞器成像的荧光生物正交探针，标记β-内酰胺抗生素，并用于细胞组织活性氧成像的双光子荧光探针。其他设计小型化荧光团的方法利用了苯环上供电子和吸电子取代基的不同模式来形成化学上的推拉系统。例如，Fang等通过简单改变苯甲酸和氮杂丁基团的数量和位置来合成变色荧光团。Yuan 等报道单苯对苯二甲酸二腈基结构的SB-Fluors能覆盖整个可见光谱，适合于线粒体活细胞成像和HClO的定量（图2）。
核酸是决定细胞功能的关键分子，因此，荧光核酸（fluorescent nucleic acids, FNAs）必须对原生对应物的分子识别特性干扰最小。现已经衍生出一系列荧光碱基（图3），分子结构可分为三种类型：同构型、扩大型和扩展型。1）同构型的代表是硫诺鸟苷，鸟嘌呤的咪唑环被噻吩取代。最新出现噻吩环被异噻唑基取代的异构体，增强了酶的识别能力；2）扩大型保持了碱基的核心结构，同时加入额外的环来改善它们的荧光性质。这些类似物可以通过在碱基的非碱基配对区域上附加苄基基团或直接将碱基配对官能团合并到新的芳香官能团中得到；3）扩展结构是最常见的非自然碱基，可以在未取代的碳上进行远端表面修饰。嘧啶中的5位点一直是扩展型碱基研究的重点，因为它不直接参与碱基配对。例如利用Suzuki–Miyaura偶联引入芳香族基团或Sonogashira交叉偶联引入小的荧光团。
FNAs最广泛的应用是光学成像，直接显示活细胞中的细胞内过程，如有丝分裂。荧光核酸还可以识别配对不匹配和DNA损伤修复 [3]，研究多核苷酸与其他生物分子之间的相互作用。
肽和蛋白质不能发出明亮的荧光，因此需要化学标签的帮助。与荧光融合蛋白和自标记标签不同，荧光氨基酸的干扰更小（图4）。本文作者团队开发了Trp-BODIPY，是首个以BODIPY为基础的荧光氨基酸，用于在体外人肺真菌病原体成像的抗菌肽中作为Trp替代品 [4]。之后还发现了其他基于色氨酸的氨基酸，它们对环境的敏感性和光学特性增强，具有更长的发射波长。例如红色荧光Trp（redBODIPY）已成功用于固相肽合成。
荧光氨基酸的小型化尺寸也已被开发用于对蛋白质进行位点特异性标记。例如用于细菌细胞壁原位标记的D-荧光氨基酸。总的来说，小荧光氨基酸库具有广泛多样的化学结构、光学读数和生物特性，将加速光学成像所需人工蛋白质和生物活性肽的设计。
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尽管一些拉曼显微镜报告证明了无标记的蛋白质、脂类、DNA和植物细胞壁可以检测到，但其灵敏度有限、光谱重叠，因此设计小型炔烃、腈和同位素标记的拉曼标签是有必要的。由于体积小，炔烃和腈是跟踪生物代谢的最小基团。
炔标记拉曼成像的典型例子是胸腺嘧啶核苷类似物EdU，可以结合到新生DNA中来监测细胞的增殖速率。使用自发拉曼光谱可在2125cm-1处检测到EdU的炔部分。随后，受激拉曼散射（SRS）显微镜提供更快的图像采集速率，已被确定为使用炔探针的生物应用的通用成像模式。炔标记拉曼成像已被用于显示小分子药物、复合天然产物和农用化学品。除炔烃外，腈和异腈基团也被用作代谢物检测的微型拉曼标签，如细菌中的鼠曲菌素和小分子药物奈拉替尼。总之，这些研究强调了最小扰动（<50 Da）炔和腈标签的生物相容性，用于使用拉曼显微镜进行代谢物成像。
由于尺寸很小，同位素取代策略是一种强大的标记方法。最典型的是氘标记。Min等人报告了一种称为氧化氘SRS（DO-SRS）的通用平台，用于小鼠从头脂肪生成成像。其他例子包括STERD平台利用氘化葡萄糖前体的代谢检测新合成的DNA、蛋白质和糖原；使用葡萄糖-d7前体观测黑色素瘤细胞模型中的脂肪酸从头合成；利用氘化谷氨酰胺和糖原前体研究癌细胞系的代谢。另外，碳的同位素替代也是使用SRS显微镜进行检测的一种方法。最近报道了使用13C标记炔烃进行多路SRS成像的新策略 [5]。由于12C/12C、13C/13C和12C/13C混合同位素的质量差异，炔烃同位素呈现离散的光谱位移，这使得能够对活细胞中的DNA、RNA和脂质进行三色检测（图5）。通过拉曼标签的各种化学修饰和同位素标记，可以实现多达二十多种代谢物的同时检测。
图5：使用炔同位素标记策略进行三色多重成像
可激活探针在成像和传感中得到广泛应用，可以实时分析多种生物分子，包括酶、离子和细胞受体等。目前已经开发了一些拉曼探针，类似于关闭-开启状态切换的荧光探针，但是，拉曼标记的窄峰特点使得其在多色光开关成像中优于荧光结构。
例如，Du和Wei开发了一种用于光激活SRS显微镜的环丙烯酮CAG系统，该系统依赖于环丙烯酮到炔烃的光转换，从而在拉曼光谱的细胞沉默区产生了开启响应；顺式1,2-二氰基-1,2双（2,4,5-三甲基-3-噻吩基）乙烯的两种异构体（即开放形式和封闭形式）分别通过UV或可见光照射可互换；Ozeki、Kamiya等人报道了第一批用于多重酶检测的可激活拉曼探针，酶活化探针包含酶识别基序和腈基，为了实现混合酶靶点的多重检测，作者采用了12C/13C和14N/15N的腈基同位素编辑策略，最终在活A549细胞中同时检测到4种靶向酶 [6]。这些研究表明，可激活拉曼探针为多路成像提供了独特的方法，具有研究生物系统复杂相互作用的潜在应用。
表1：代表型光学探针
参考文献：
[1] Benson S, de Moliner F, Tipping W, Vendrell M. Miniaturized Chemical Tags for Optical Imaging. Angew Chem Int Ed Engl. 2022;61(34):e202204788. doi:10.1002/anie.202204788.
[2] Matikonda SS, Ivanic J, Gomez M, Hammersley G, Schnermann MJ. Core remodeling leads to long wavelength fluoro-coumarins. Chem Sci. 2020;11(28):7302-7307. Published 2020 Jul 3. doi:10.1039/d0sc02566f.
[3] Zhu RY, Majumdar C, Khuu C, et al. Designer Fluorescent Adenines Enable Real-Time Monitoring of MUTYH Activity. ACS Cent Sci. 2020;6(10):1735-1742. doi:10.1021/acscentsci.0c00369.
[4] Mendive-Tapia L, Zhao C, Akram AR, et al. Spacer-free BODIPY fluorogens in antimicrobial peptides for direct imaging of fungal infection in human tissue. Nat Commun. 2016;7:10940. Published 2016 Mar 9. doi:10.1038/ncomms10940.
[5] Chen Z, Paley DW, Wei L, et al. Multicolor live-cell chemical imaging by isotopically edited alkyne vibrational palette. J Am Chem Soc. 2014;136(22):8027-8033. doi:10.1021/ja502706q.
[6] Yamaguchi S, Matsushita T, Izuta S, et al. Chemically-activatable alkyne-tagged probe for imaging microdomains in lipid bilayer membranes. Sci Rep. :41007. Published 2017 Jan 24. doi:10.1038/srep41007.
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