乳腺癌是全世界女性与癌症相关的死亡的主要原因。作为异质性疾病，乳腺癌已被分类为几种分子亚型，包括HER2阳性乳腺癌，其定义为具有扩增和/或过表达的HER2（或erbB2）基因的亚型。在大约20–25％的乳腺癌中观察到HER2的扩增/过度表达，并且与乳腺癌患者的不良预后显著相关。赫赛汀是一种人源化的抗HER2单克隆抗体，是针对早期和转移性HER2阳性乳腺癌的有效HER2靶向疗法。它显著提高了患有HER2阳性肿瘤的乳腺癌患者的生存率。但是，并非所有HER2阳性乳腺癌都对基于赫赛汀的治疗方案有反应。多数获得初始反应的患者会在一年之内成为耐药患者。抗药性肿瘤可能会复发并转移到远处器官，约占癌症死亡人数的90％。许多HER2阳性晚期乳腺癌的患者最终会发展为脑转移。迄今为止，缺乏可预测的赫赛汀反应的有效生物标志物。因此，深入了解HER2阳性乳腺癌中赫赛汀耐药性形成的机制有助于发现新的有效靶点，进而开发更有效地靶向治疗，具有重要的临床意义。
2021年5月11日广州医科大学附属肿瘤医院郑国沛、贺智敏及易斯安那州立大学Liu Bolin等科学家联合在《NATURE COMMUNICATIONS》（2019年影响因子12.121）上在线发表了题为“Disruption of FOXO3a-miRNA feedback inhibition of IGF2/IGF-1R/IRS1 signaling confers Herceptin resistance in HER2-positive breast cancer.”的文章，揭示了赫赛汀耐药乳腺癌中IGF2/IGF-1R/IRS1信号激活的关键机制。
研究思路及方法
该研究中，郑国沛教授团队利用来自于HER2阳性乳腺癌细胞株SKBR3和BT474，及其诱导的赫赛汀耐药的SKBR3-pool2 (pool2) 和 BT474-HR20 (HR20)细胞株，探索IGF-1R信号通路的调控机制。在pool2和HR20细胞中，IRS1和磷酸化的IGF-1R (p-IGF1R)、Akt(p-Akt(T308)和p-Akt(S473)、S6K (p-S6K)和FOXO3a (p-FOXO3a)水平分别高于SKBR3和BT474细胞。赫赛汀耐药细胞的条件培养基中IGF2蛋白水平明显高于敏感细胞。通过特异性shRNA或CRISPR-Cas9基因编辑下调IRS1，显著地使耐药细胞对赫赛汀治疗重新敏感。IGF-1R抑制剂、Akt 抑制剂和mTOR抑制剂逆转了pool2和HR20细胞的抗性表型。过表达IRS1联合高剂量(80 ng/ml) rhIGF2可将SKBR3和BT474转化为赫赛汀耐药细胞。这些数据表明，IGF2/IGF-1R/IRS1信号维持赫赛汀耐药表型。
图1. IGF2/IGF-1R/IRS1/Akt/mTOR信号通路参与了her2阳性乳腺癌细胞对赫赛汀的耐药
IGF2在高剂量(80 ng/ml)诱导IGF-1R/Akt/mTOR信号通路负反馈抑制。过表达IRS1并没有改变rhIGF2对p-IGF-1R水平的影响，但挽救了rhIGF2 (80ng /ml)诱导的p-Akt(T308)、p-Akt(S473)、p-S6K和p-FOXO3a的减少。通过特异性shRNA或CRISPR-Cas9基因编辑下调FOXO3a表达不仅提高了IRS1的基础水平，还消除了rhIGF2 (80 ng/ml)诱导的IRS1下调。FOXO3a驱动IRS1表达的可能是IGF2 (80ng /ml)诱导的负反馈抑制HER2阳性乳腺癌细胞信号通路的重要机制。
图2.FOXO3a和IRS1在her2阳性乳腺癌细胞中调控igf2触发的IGF-1R/Akt/mTOR信号的负反馈抑制
荧光素酶报告实验表明miR-128-3p和miR-30a-5p直接靶向IRS1。通过特定的shRNA或CRISPR-Cas9基因编辑下调FOXO3a不仅降低了miR-128-3p和miR-30a-5p的基础水平，而且取消了rhIGF2 (80ng /ml)诱导的miRNA的上调。染色质免疫沉淀(ChIP)随后的qPCR分析表明，FOXO3a调控miR-128-3p、miR-30a-5p。上述结果显示了FOXO3a转录调控miR-128-3p和miR-30a-5p在HER2阳性乳腺癌细胞中控制IRS1表达的关键作用。
图3. FOXO3a控制miRNAs影响IRS1表达和负反馈抑制IGF-1R/Akt/mTOR信号通路
接下来，作者试图探索IGF2触发IGF-1R/Akt/mTOR信号负反馈抑制过程中改变p-FOXO3a水平的潜在机制。基本活性维持PPP3CB（丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2B的一个亚基）的表达，以限制FOXO3a磷酸化（p-FOXO3a），诱导靶向IGF2和IRS1的miRNA。
图4.PPP3CB介导的p-FOXO3a水平下降改变了反馈调控
进一步明确FOXO3a-miRNA轴的失调是导致赫赛汀耐药的关键性影响因素，作者使用分子抑制剂分析这些数据确立了FOXO3a通过转录调控特定miRNA来控制IGF2和IRS1表达的重要作用，从而改变HER2阳性乳腺癌细胞中赫赛汀的敏感性。
图5.FOXO3a-miRNAs轴失调导致赫赛汀耐药
ChIP-qPCR分析显示， p-STAT6在PPP3CB启动子的预测结合位点富集。Co-IP检测证实了p-STAT6和HDAC1在赫赛汀耐药细胞中相互作用。而Src抑制剂SU6656降低了p-STAT6。在赫赛汀耐药乳腺癌细胞中Src激酶的激活(由p-Src的增加证明)可能促进STAT6的磷酸化从而增强其与HDAC1的相互作用，随后p-STAT6/HDAC1复合物协同抑制了赫赛汀耐药乳腺癌细胞中PPP3CB的表达。
图6.src介导的STAT6/HDAC1信号通路降低了赫赛汀耐药细胞中PPP3CB的表达
作者在体外动物实验中验证了IRS1对HER2阳性乳腺癌赫赛汀体内疗效中的作用。赫赛汀联合特异性下调IRS1导致了对肿瘤生长的持续显著抑制。此外，ELISA分析结果表明，赫赛汀反应差患者血清IGF2水平明显高于反应好患者血清IGF2水平。
图7. PPP3CB/FOXO3a/IRS1信号通路导致体内对赫赛汀反应不佳
研究总结
1. 在赫赛汀敏感细胞中，FOXO3a调节特定的miRNA，以控制IGF2和IRS1的表达，并保留基本的IGF2 / IGF-1R / IRS1信号传导。基本活性维持PPP3CB的表达，以限制p-FOXO3a，诱导靶向IGF2和IRS1的miRNA。
2.在赫赛汀抗性细胞中，由于PPP3CB的转录抑制，p-FOXO3a水平升高，从而破坏了FOXO3a和miRNA形成的负反馈抑制环，从而上调了IGF2和IRS1。
3.对含赫赛汀治疗方案反应较差的乳腺癌患者的肿瘤中血液中的IGF2和IRS1显著增加。
吉凯助力
该研究中使用慢病毒介导的 CRISPR-Cas9 技术产生乳腺癌细胞中的基因缺失由吉凯基因提供，实现高效特异的基因敲除效率。
作者简介
广州医科大学肿瘤研究所郑国沛，贺智敏及易斯安那州立大学Liu Bolin为本文通讯作者。郑国沛研究员为最后通讯作者。
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