很多小伙伴做WB时，问蛋白定量需不需要做？做了定量，内参还是不齐，蛋白定量准不准？带着这些疑问，小编带大家梳理一下WB的蛋白定量。
WB实验需要对样品总蛋白进行定量，主要目的是对样品进行均一化处理，也就是使各个泳道蛋白总上样量一致。
特别提醒这里的总上样量一致，是以质量单位上样（ug/孔）而不是以体积单位上样（ul/孔）。
举个例子
看下图目的蛋白表现出了表达量的差异性！
再看一下内参的表达量：
原来上样量不均一！图片中有些样品间表达水平差异没有意义。
再看下面一张图：
内参均一性非常好，这样才能说明目的蛋白的差异是有意义的。
另外还可以根据定量结果，优化上样总量，以得到更佳的结果。下图上样量太大，出现过曝反白。
蛋白质种类很多，结构、功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量的方法带来了许多困难。目前依据不同的原理，已经出现多种蛋白定量的方法。
总蛋白定量的方法主要有Bradford法，BCA法，紫外分光光度法，lowry法等。
今天小编主要和大家讨论一下Bradford法和BCA法。
Bradford法 和 BCA法
| BCA 法 | Bradford法 | |
|---|---|---|
| 原 理 | | |
| 吸光值 | A=562nm | A=595nm |
| 优 点 | 1、测定迅速简单，正常45分钟内完成测定。 2、不受大部分样品中的去垢剂等化学物质影响。可兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween-20。 3、线性范围：20-2000µg/mL（样品体积20ul）检测范围广且线性稳定。 4、不同蛋白质分子的变异系数小。 | 1、操作快速简便，室温孵育10min即可。 2、兼容大多数还原剂和金属螯合剂。 3、线性范围：100-1,500 µg/mL（样品体积20ul）。 |
| 缺 点 | 1、受金属离子螯合剂（EDTA等），还原剂（DTT，巯基乙醇等） 影响。 | 1、易受到表面活性剂Triton X-100、SDS等影响。 2、随着蛋白浓度增加，标准曲线有轻微的非线性。 3、不同蛋白质测定时有较大的偏差。 |
BCA法和Bradford法均需制作标准曲线，需要注意：
1、因为显色反应与温度和时间的变化有关，为了尽可能准确测定未知样品中的总蛋白浓度，建议每次进行分析时都应制作标准曲线。
2、超出标曲范围内的数值无法确定，务必保证样品数据在标准曲线范围内。
3、为了减小误差，建议做3个复孔。
要根据样品的组份，定量的区间，反应的时间，仪器设备等综合判断分析，选择最合适的方法。
主要看样品中去垢剂，如果你的蛋白抽提试剂含有大量去垢剂，请选择BCA法。
如果你的样品中含有EDTA等金属螯合剂(BCA法中Cu离子被螯合走)，或者含有还原性，建议选择Bradford法。
BCA蛋白定量：（操作视频）
操作步骤
1、计算并配置工作液；
2、加入即用型标准品或梯度稀释的标准品，以及待测样品；
3、加入BCA工作液。37℃孵育30min；
4、测A562nm吸光值；
5、制作标准曲线，并计算样品浓度。
绘制标准曲线 计算样品浓度
一
二
三
四
五
六
常见问题：
1、有小伙伴问，我提取细胞样本，可不可以通过细胞计数的方法代替蛋白定量？
至少预实验的时候建议做蛋白定量。虽然蛋白定量主要目的是对样品进行均一化处理，保证上样量一致。但是另一个作用优化上样量，也十分重要。上样量太低，目标蛋白可能检测不到；上样量太高有可能导致过曝，灰度值分析误差大。有文献报道总蛋白上样量超过10ug/孔时内参蛋白不够敏感，无法检测到差异。内参蛋白理想的上样量5ug以内，目标蛋白的上样量为10-20ug。
2、定量后，内参还是不齐？
首先，蛋白定量环节：注意样品中是否含有干扰物质，选择适合的定量方法；检测的值是否在线性范围内；做复孔，减小误差。
其次，转膜环节：注意转膜的均一。
最后，注意内参蛋白的选择是否合适。比如GAPDH是常用的内参蛋白，但是GAPDH是糖酵解过程中的一个酶，在缺氧，糖酵解紊乱等情况会增加GAPDH在特定细胞中的表达。内参蛋白要选表达不受实验处理影响的蛋白。
现在也有很多人用总蛋白作为内参，即通过考马斯亮蓝或者丽春红染总蛋白，伯乐推出stain-free免染胶，也可以准确反应每个泳道中的蛋白量，可以作为WB的可靠内参。
3、样品间浓度差异大，如何调节浓度？
样品提取时，组织样品可以通过称量，细胞样品可以通过计数，等比例加入提取液。这样各组样品浓度差异就不会非常大了。
| 货 号 | 产品名称 | 规 格 | 产品价格 |
|---|---|---|---|
| ZJ102 | Omni-Easy™即用型BCA蛋白定量试剂盒 | 500次(微孔) | 298元 |
| ZJ102L | Omni-Easy™即用型BCA蛋白定量试剂盒 | 500次(微孔)×5 | 888元 |
g 方便快捷——提供即用型标准品，省去繁琐的稀释步骤；
g 准确性高——变异系数远小于考马斯亮蓝染色法；
g 线性范围宽——灵敏，检测范围：20~2,000 μg/mL；
g 兼容性好——与金属离子、还原剂、螯合剂及去污剂兼容性较好。
使用ZJ102/102L引用文献：
1、 Cheng, B., Zhang, H., Hu, J., Peng, Y., Yang, J., Liao, X., ... & Lu, H. (2020). The immunotoxicity and neurobehavioral toxicity of zebrafish induced by famoxadone-cymoxanil. Chemosphere, 247, 125870. (IF 7.086)
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3、 XIAO, Lili, et al. Molecular Behavior of HMGB1 in the Cochlea Following Noise Exposure and in vitro. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2021, 9: 350.（IF 6.684）
4、WANG, Feng, et al. Accelerated Bone Regeneration by Astragaloside IV through Stimulating the Coupling of Osteogenesis and Angiogenesis. International Journal of Biological Sciences, 2021, 17.7: 1821.（IF 6.58）
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