蛋白质组（proteome）早在1994年由澳大利亚科学家Wilkins和Williams提出，1995年7月早诸见Electrophoresis 杂志，主要只是指一个细胞或组织中由基因组表达的全部蛋白质。蛋白质组学（proteomics）则是通过高通量技术研究某一类细胞、组织所有蛋白的组成、功能及相互作用。在蛋白质组学的研究中，蛋白的数量庞大，而其研究最广泛的蛋白鉴定的方法就是将质谱获得的蛋白质的肽段图谱数和数据库中的蛋白质序列做比对，就是我们现在常用的基于质谱的方法去对蛋白进行定性和定量。

随着技术的发展，是否有更精准的或者更微量的技术作为蛋白质组学发展的技术支撑呢？答案是显而易见的，联川生物基于PEA的技术，已经开启Olink蛋白质组学的技术服务，“Olink蛋白质组，见微识真”，接下来跟着付老师的脚步了解PEA技术的发展、优化及商业化之路。

一、PEA技术的前身

1．PEA技术简介

邻位延伸分析技术（Proximity Extension Assay, PEA）是Olink独有的—种高通量、高特异性、高灵敏度、高动态范围的靶向蛋白质组定量技术。针对每个待检蛋白，Olink设计了一对抗体，抗体上偶联有特定的DNA单链，当这对抗体结合目标蛋白后，处于邻位的两条DNA单链可互补结合并经酶延伸形成双链DNA模板，巧妙地将蛋白质定量转换为DNA定量，最后利用微流控qPCR或NGS测序进行定量检测。

2 .PEA的发展

PEA其实是由Proximity Ligation Assay (PLA)优化而来的方法。2002年，Ulf Landegren团队提出PLA这一技术，其原理是利用DNA aptamers结合目标蛋白，aptamers上的互补探针进行近距离杂交，将杂交的探针进行扩增后通过PCR实现定量。

方法和原理简介：

体外DNA扩增技术的作为PLA技术实现的基础，Ulf Landegren团队提出一种类似的蛋白质检测技术,主要是通过协调和近端结合靶蛋白的两个寡核苷酸，通过目标蛋白与两个DNA对应的配体的近端结合，而配体上有特异结合的探针，结合探针产生的amplifiable DNA序列就可以侧面反映蛋白的定性和定量。

通常来说对基因组序列数据分析大量的蛋白的浓度、定位、甚至是二次修饰都需要特别敏感和特体的方法，相比之下用于检测特定核酸序列的方法，如PCR，具有良好的敏感性和特异性。不仅仅是通过互补的核酸链预测的亲和力的反应其部分结果，更重要的是要成对的探针识别给定的目标序列，双重作用才能启动放大的检测信号。这种对双重和近似识别的要求也是信号转导和基因调控中细胞识别反应的一个常见的的情况，更能真实反应生物复杂的信号级联放大作用。Ulf Landegren把这项开发的技术称为proximity ligation，该方法依赖于对亲和探针同时和近似地识别目标分子，从而产生可放大的检测信号。

Ulf Landegren团队通过PLA技术对PDGF-BB的检测来更清晰阐述技术的原理和细节

1）PDGF-BB 是血小板衍生生长因子B的同源二聚体(PDGF-BB)是一种具有促进生长和分化作用的细胞因子

2)接下来需要寻找与PDGF-BB可以进行结合的配体，并可以进行后续的实验研究，文献报道有一个与PDGF-BB有亲和关系的DNA配体在5 '或3 '端有额外的序列元件扩展，形成一个邻近探针对。

3）当一对探针结合PDGF-BB时，其序列延伸的自由端被足够靠近，与随后添加的连接器寡核苷酸杂交，允许末端被酶连接DNA连接，这样被检测的蛋白质分子通过将邻近探针对的自由端结合在一起来促进连接反应，连接产物可以通过PCR进行核酸扩增，而未反应的探针保持沉默。

4）那么我们看下示意图就更加容易理解

1同源二聚体PDGF-BB的示意图由两个基于aptmer的邻近探针A1和A2结合黑色左侧为A1特异性核酸适配体41t的序列

2蓝色(A1)和红色(A2)为杂交后连接到普通接头核苷酸的序列延伸

3黑色框框为PCR引物位点，绿色显示通过5 ' 核酸酶检测实时检测PCR产物的探针

文章中除了对PLA的设计和原理进行详细阐述，还对蛋白结合的配体的核苷酸序列长度的影响、模板连接邻近探针孵育的时间的长短、样品的检测的灵敏度以及和重现性都进行了讨论，对这项技术感兴趣的老师可以去看看这篇文献。

二、PEA技术的优化之路

生物标志物检测取决与其超灵敏的检测，并且对疾病的的诊断和治疗也起到了至关重要的作用；而PEA的技术原理就是基于核酸的高灵敏检测的方法。Landegren团队提出的蛋白质检测技术,主要是通过协调和近端结合靶蛋白的两个寡核苷酸，通过目标蛋白与两个DNA对应的配体的近端结合，而配体上有特异结合的探针，结合探针产生的amplifiable DNA序列就可以侧面反映蛋白的定性和定量。

2004年，同样是Ulf Landegren教授团队，用一对特异性抗体替代最早的DNA-Aptamer核酸适配体，从两个寡核苷酸向抗体的技术优化，而这种临位的延伸技术其实也算是IPCR的一种衍生技术，PLA技术的优化在于DNA序列本身是可以特异性的识别靶蛋白的抗体或适配抗体，实际情况中如果有两个或者两个以上的分子同时识别一个靶蛋白的时候，链接在上面的DNA序列就会相互靠近，于此同时加入一段与DNA分子互补的序列和链接酶就可以按照PCA反应的模板进行扩增，与传统的ELISA相比，Landergren等人用该方法将PDGF-BB的检测灵敏度提高了1000倍。不仅仅特异性比较好，背景本身也会比较低，同时结合高效的PCR扩增，可以达到很高的灵敏度。优化后的PLA技术实现了可在1微升样品中检测出fmol 级目标蛋白，且可进行高通量和超多重检测。

PLA优化示意图

PLA优化主要步骤 1）带有探针的抗体对样本孵化1h 2）链接和PCR检测 5min 3）定量PCR 2h

PLA的高通量、高敏感和超多重检测的优势，在2008年多家实验室和医院利用PLA技术进行于血浆样品多重生物标志物的检测，其研究成果发表Clinical Chemistry，研究表明与固相方法相比较，PLA技术在一致性、灵敏度和拓展性上更加卓越。

2008年PLA技术用于血浆多重标志物的检测

2011年，Olink Bioscience（Olink Proteomics 前身），研究学者提出PLA技术是利用DNA连接酶促进互补探针的结合，因而难以避免复杂样品中的成分对DNA连接酶效率的影响，并提出使用杂样品中酶活性更高且更稳定的DNA聚合酶，也就是今天我们现在应用的PEA技术(邻位延伸技术)。

PEA的示意图1）样品孵育后，邻近探针结合其特异性抗原2）探针寡聚体相互靠近并杂交，DNA聚合酶的加入使杂交寡聚体的扩展4）DNA模板的qPCR定量和检测

2011年 PLA邻位连接分析技术升级优化为PEA邻位延伸技术

以上就是PEA技术的发展的优化之路，技术不断的更新迭代是给科研工作者提供探讨更多未知的可能；联川生物有幸能在这个时代站在巨人的肩膀上为科研工作者提供更优质的科研服务。

三、基于PEA技术的发展的Olink Proteomics

在2014年Olink Bioscience的研发团队联合Copenhagen大学健康和医学研究院，开发出基于qpcr平台的PEA技术，即96-plex PEA法，可一次性实现96种蛋白的定量。

Olink Bioscience开发 96-plex PEA法

96-plex PEA 的设计及原理

（A）94对特异性抗体配有寡核苷酸（PEA探针）和与含有抗原的样品混合

（B）所有接近探针对结合其特异性抗原，从而产生探针杂交的寡核苷酸。寡核苷酸具有独特的退火位点，允许配对探针成对结合，DNA聚合酶的加入使两个寡核苷酸的延伸和连接，并形成PCR模板。

（C）通用引物用于并行预扩增所有96个不同的DNA模板

（D）尿嘧啶DNA糖化酶部分消化DNA模板并去除所有未结合的引物

（E）每个单独的DNA序列都通过微流控qPCR使用特异性引物进行检测和定量

2016年基于PEA的开创性研究成果，Olink Proteomics公司正式成立，PEA技术开始商业化，公司致力于为血浆等体液蛋白质组、蛋白标志物的发现、转化医学提供技术服务。

在2017和2020年，PEA OlinkTM Focus 订制化平台和OlinkTM Target 48重检测平台分别发布，以更适应Mid-plex生物标志物检测市场需求。同年Olink公司推出 Explore 384/1536 平台，可同时检测384或1536中蛋白生物标志物。

2021年下半年，Olink推出专为Target 96/48/Focus全新设计的Signature Q100检测仪器。在NGS测序技术基础上。

2021年5月钟雯博士（第一作者）在《Nature Communication》杂志上，运用Explore 1536平台研究二型糖尿病患者在二甲双胍治疗前都血浆蛋白组改变，发现4个蛋白标志物在治疗前/后显著差异表达。

2021年下半年，Olink又在全球范围内发布Explore 3072平台，可从8微升样品中检测超过3000种蛋白标志物，并覆盖100%主要生物学通路；这意味着，血浆蛋白组检测实现了生物学意义上的无偏，具有划时代的意义。

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作者简介：付俊联川生物高级产品经理，谦逊组学服务行业内一股清流，人称付老师。2017年加入联川生物，曾担任联川生物项目经理、生信工程师、转录调控一组组长，近3年多组学服务经验， 2年售前及质谱产品开发经验，服务科研客户均口碑相传。目前负责联川生物质谱线的产品优化和更新，擅长多组学角度进行数据深入挖掘。

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