原文出处：Zhong W, Wu K, Long Z,et al. Gut dysbiosis promotes prostate cancer progression and docetaxel resistance via activating NF-κB-IL6-STAT3 axis. Microbiome. 2022 Jun 16;10(1):94.
研究背景：
据GLOBOCAN 2020 年数据统计，前列腺癌在全球男性的发病率中排名第二，死亡率位居第五。因此，探究前列腺癌的发病机制和新的治疗方法十分必要。过去十年中，越来越多的研究聚焦在肠道微生物群对肿瘤进展以及治疗的作用。然而，现有研究多集中在肠道微生物群与肠道肿瘤之间的联系，关于肠道微生物如何影响肠外恶性肿瘤（如前列腺癌）仍知之甚少。本研究中，作者猜想抗生素处理可导致肠道微生物群失调进而激活炎症信号通路并促进前列腺癌的进展。研究发现抗生素处理可促进前列腺癌的生长，其作用由肠道微生物群介导。研究结果：
结果一：广谱抗生素处理可导致小鼠肠道菌群失调，进而促进前列腺癌生长。
作者首先连续给予C57BL/6J小鼠广谱抗生素（Abx）处理，包括氨苄青霉素、粘菌素、新霉素和万古霉素，以建立肠道微生物群失调小鼠模型。随后将RM-1细胞移植到小鼠皮下建立前列腺癌皮下移植瘤模型。（图1A）4-5 周后，与对照组相比，抗生素干预增加了皮下肿瘤体积和重量。（图1B）在原位移植的肿瘤中也观察到了相同的结果。（图1C）此外，为了进一步确定肠道微生物群是否介导这一现象，作者进行了粪菌移植实验（FMT）。结果显示，与 FMT对照组相比，FMT-Abx 组的皮下肿瘤体积和重量增加。（图1E）肿瘤组织的免疫组织化学分析显示，Abx 和 FMT-Abx 组中 Ki-67 阳性肿瘤细胞的数量增多。（图1F）以上结果表明抗生素干预促进了小鼠前列腺癌的生长，这与肠道微生物群失调有关。图1
结果二：抗生素处理后，肠道中变形菌门的相对丰度显著升高。
为了探究肠道微生物群的组成，作者收集了来自小鼠的粪便样本，包括Abx、FMT-Abx、NC和FMT-NC组，并进行 16S rRNA 测序。主坐标分析结果表明Abx和FMT-Abx组之间以及NC和FMT-NC 组之间的菌群组成相似。（图2A）接下来，在不同的分类水平上评估了四组的肠道微生物群谱。作者发现，在门水平上，拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度在NC和FMT-NC组中占优势，而变形菌门的相对丰度在Abx和FMT-Abx组中显著富集。(图2B)在科水平上，ABX和FMT-ABX组中，鼠杆科和毛螺科显著减少。(图2C)为了确定每组中的生物标志物物种，作者计算了线性判别分析效应大小后发现变形菌是ABX和FMT-ABX组中得分最高的物种。（图2D）总之，抗生素干预显著改变了肠道细菌群落的组成。变形杆菌的相对丰度增加，是肠道微生物群失调的标志。图2结果三：瘤内LPS激活NF-κB-IL6-STAT3轴
LPS作为一种重要的炎症诱导因子，在人类多种肿瘤中均可检测到，随后作者猜想肠道微生物群失调（以变形菌门富集为特征）导致肠道屏障受损，LPS释放到循环中，进而到达肿瘤。为了证明这一点，作者进行了ELISA实验，结果表明，虽然NC组粪便中的LPS水平明显高于Abx组，但血清中却有相反的趋势。此外，在Abx组的结肠中观察到一定程度的损伤。(图3A)以上结果表明，ABX组小鼠存在肠漏。此外，LPS在ABX组的肿瘤中显著增加。（图3B）已知 LPS 通过激活 TLR4-NF-κB 通路刺激多种细胞因子分泌来引发炎症反应。作者通过大肠杆菌的重组LPS培养RM-1细胞，并通过RT-qPCR检测细胞因子的转录水平。作者发现IL-6的相对倍数变化明显高于其他细胞因子。随后，ELISA实验证实细胞上清液中IL-6的蛋白水平也显著升高。（图3C）随后作者通过RPPA和基因富集分析发现IL6和p-STAT3之间呈正相关，显示JAK-STAT通路上调。（补充图2A）同时，作者发现p-STAT3和p-p65（NF-κB的主要转录亚单位）的表达水平之间存在正相关。（补充图2B）此外作者发现p-p65和p-STAT3在给予LPS的RM-1细胞核中增加（图3D），并呈剂量依赖性。给予p65磷酸化抑制剂处理后，IL6的转录水平以及p-p65和p-STAT3的蛋白质水平降低。（图3E）体内实验中作者通过ELISA检测发现与对照组相比，ABX组的肿瘤组织裂解物和血清中的IL6浓度增加，WesternBlot和免疫组织化学分析所示，p-p65和p-STAT3的表达也增加。（图3F、G）以上结果表明在肠道通透性上调的情况下，肿瘤内LPS升高，并激活了NF-κB-IL6-STAT3轴。
图3
补充图2
结果四：IL6-STAT3通路的激活促进前列腺癌生长和多西他赛耐药IL6-STAT3 通路已被证实能够促进多种恶性肿瘤的进展，并且与对多西他赛、5-氟尿嘧啶和其他临床化疗药物的耐受性有关STAT3 下游增殖相关基因，如细胞周期蛋白 D1 和 c-myc，在 RM-1 和 DU-145 中都相应改变（图 4A）。同时，采用Edu检测法和克隆形成法检测前列腺癌细胞的体外增殖能力，结果表明抑制IL6-STAT3通路抑制了前列腺癌细胞株的增殖。（图4B、C)体内实验中与Abx组相比，ABX STATTIC(STAT3磷酸化抑制剂)组肿瘤体积 (p < 0.001) 和重量显著降低。(图4D）肿瘤组织的免疫组织化学分析表明，与 NC 组相比，Abx 组的 p-STAT3、cyclin D1 和 c-myc 的表达增强，而 Abx Stattic 组的 p-STAT3、cyclin D1 和 c-myc的表达降低。（图4E）
多西他赛作为前列腺癌的一线治疗药物，临床上其潜在耐药机制之一是激活IL6-STAT3通路。细胞活力和TUNEL分析表明，抑制IL6-STAT3途径可改善前列腺癌细胞系对多西他赛的耐受性（图5B、C）。体内实验进一步证实了这一结论。多西他赛显著降低了正常喂养小鼠的肿瘤体积和重量，但未能降低肠道微生物群失调小鼠的肿瘤体积和重量。然而，多西他赛和Stattic联合使用显著减少了肿瘤体积和重量。（图5D）肿瘤组织的免疫组织化学分析显示，p-STAT3、Bcl-2和Survivin的表达也显著减少（图5E）。以上结果表明，IL6-STAT3通路在肠道微生物群失调小鼠的肿瘤中被激活，并促进前列腺癌的增殖和多西他赛化疗耐药性。
图4
图5
结果五：转移性前列腺癌患者肠道中变形菌门的相对丰度增加
上述结果表明，肠道微生物群失调促进小鼠前列腺癌的进展。然而，了解肠道微生物群对前列腺癌进展风险的影响需要来自临床患者样本的进一步证据。作者选取良性前列腺增生（BPH，n=20），非转移性前列腺癌(n = 10) 和转移性前列腺癌的患者 (n = 5) 进行后续探究。作者对来自患者的粪便样本进行 16S rRNA 测序，发现 α-和 β-多样性在三组之间没有显著差异（图 6A、B）。然而门水平的细菌组成表明，转移性前列腺癌患者中变形菌门的相对丰度高于非转移性前列腺癌或 BPH 患者，并且在前列腺癌和 BPH 患者之间也观察到差异。（图6C）接下来，作者对变形菌门与多个临床参数进行相关性分析，结果显示变形菌门的相对丰度与血浆IL6水平、区域淋巴结转移状态和远处转移状态呈正相关。（图6D） 最后， ROC曲线显示，尽管变形杆菌无法区分前列腺癌和 BPH，但它在预测远处转移方面的潜力要优于 PSA 水平（在转移性前列腺癌患者中往往更高）。
图6
研究结论
抗生素处理导致肠道菌群失调，特征为变形杆菌富集，进而使肠道通透性和瘤内LPS升高，通过 NF-κB-IL6-STAT3 轴促进前列腺癌的发展。
校对：张丹
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