在内皮细胞（endothelial cell，EC）中，血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor receptor type 2，VEGFR2）信号通路、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和铜（copper，Cu）对修复血管生成至关重要。今天要给大家分享的是一篇发表在《Nature Cell Biology》（2022年IF=28.213，JCR分区=Q1）杂志上的文章：“Cysteine Oxidation of Copper transporter SLC31A1/CTR1, drives VEGFR2 signaling and Angiogenesis”。此文章研究探讨铜转运蛋白（copper transporter，CTR1）与ROS传感器的重要机制，以及它们如何促进血管新生。接下来，我们分享一下作者是如何展开研究的。
1. 在VEGF刺激下，CTR1在胞质C端的半胱氨酸（cysterine，Cys）189处迅速亚磺酰化，从而CTR1-VEGFR2二硫键形成。
2. CTR1与早期核内体（early endosomes，EEs）共内化，促进VEGFR2信号的通路。
3. 在体实验中EC特异性敲除CTR1的小鼠，其发育和血管生成修复严重受损。
4. 因此，CTR1 Cys189区的氧化促进VEGFR2内化及信号转导，从而诱导血管生成。
1. 体内实验明确内皮细胞CTR1促进血管生成
此实验用视网膜新生血管动物模型检测P6幼鼠视网膜的芽生式血管生成，结果显示，Ctr1iECKO小鼠延迟血管丛膨胀至外周，且血管长度显著减少；与野生型（wild type，WT）小鼠相比，出芽式血管分支点、顶端细胞和丝状足的数量显著增多（图A）。Ctr1iECKO小鼠视网膜中，在生长中的神经丛的前缘中内皮细胞标志物（同工凝集素B4 细胞）上增殖细胞（BrdU ）的数量显著降低（图B）。对下肢缺血（hindlimb ischemia，HLI）产生反应时，Ctr1iECKO小鼠CD31 毛细血管的灌注恢复，血管生成显著受损（图C）。与WT小鼠相比，Ctr1iECKO小鼠的伤口愈合率和损伤组织中CD31 毛细血管的密度显著降低（图D），且VEGF诱导及基底的血管新生明显受损（图E）。综上所述，内皮CTR1对发育和VEGF/缺血/创伤损伤诱导的修复性血管生成至关重要。
2. 明确敲除CTR1会阻碍内皮细胞内VEGF信号通路和血管生成
改良的Boyden小室法（Boyden chamber assay）结果显示，CTR1小干扰RNA（small interfering ribonucleic acid，siRNA）转染人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）后（图A），或从Ctr1iECKO幼鼠分离EC后（图D），显著抑制VEGF诱导EC迁移。毛细管形成实验（capillary tube formation assay）结果显示，敲除CTR1后显著抑制VEGF诱导基质胶上管分枝数量增多且长度更长，也阻止纤维蛋白凝胶中发芽的数量增多（图B）。此外，siRNA敲降CTR1显著阻碍VEGF诱导p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK和p-Akt的水平（图C）。另外，mCtr1KO EC几乎完全抑制VEGF诱导的信号传导（图E）。由于Cu入胞激活Cu依赖酶，所以赖氨酰基氧化酶（lysyl oxidase，LOX）涉及血管生成；此外，Cu入胞促进Cu与MEK1/2结合，从而增加p-ERK1/2的表达水平。四硫钼酸盐（tetrathiomolybdate，TTM）是一种细胞透性铜螯合剂，其对VEGF诱导的p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK和p-Akt水平无显著影响（图F）。因此，CTR1参与VEGFR2血管生成信号时，不依赖Cu在EC中的转运功能。
3. 明确CTR1-Cys189OH促进VEGFR2信号通路和血管生成
ROS（特别是H2O2）由NOXs产生（包括NOX4），其显著地影响EC的VEGF信号通路和血管生成，以及修复性新生血管。此外，CTR1 siRNA不影响VEGF诱导二氯荧光黄（dichlorofluorescein，DCF）荧光性增加——即细胞内的氧化状态（图A）。CysOH捕获探针（DCP-Bio1）的结果显示，1）5 min内，VEGF迅速促进CTR1转变成CysOH，2）30 min时，CysOH值达到峰值，且3）4 h内，CysOH降至基础水平（图B）。Nox4基因敲除阻止VEGF诱导CTR1-CysOH组合（图C），也抑制VEGF诱导DCF荧光和血管形成反应。与Flag-CTR1-C190A（阴性对照）相比，腺病毒表达的Flag-CTR1-C189A（在Cys189位点形成CTR1-SOH分子间二硫键配合物）几乎完全抑制VEGF诱导CTR1形成CysOH（图D）。Flag-CTR1-C189A（非Flag-CTR1-C190A）过表达抑制VEGF诱导EC迁移（图F）或毛细管网形成（图G），而不影响ROS产生（图E）。为论证CTR1的内源性Cys修护，研究结果显示，使用规律间隔成簇短回文重组序列（clustered regulatory interspaced short palindromic repeats，CRISPR）-Cas9基因组编辑产生半胱氨酸氧化缺陷，即mCtr1-C187A（对应于人体CTR1-C189A）敲入突变体（mCtr1- KI）的小鼠（图H）。对比于WT-EC，从mCtr1KI/KI小鼠隔离的EC（即mCtr1KI/KI EC）中VEGF诱导的VEGFR2信号通路（图I），以及EC迁移（图J）被显著抑制。
4. 明确CTR1-Cys189OH促进CTR1/VEGFR2共内化
细胞表面生物素化实验（cell surface biotinylation assay）结果显示，1）5 min内，VEGF促进CTR1内化（内化是生物大分子与细胞相互作用的中心环节，指细胞通过胞吞等作用，将物质摄入细胞内，将其消化为自己的一部分），此过程持续2 h；2）随后的4 h内，CTR1内化回归至细胞表面；3）上述过程与VEGFR2内化同时发生及恢复（图A）。免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）实验结果显示，1）内皮细胞中VEGF刺激促进CTR1在5分钟内与VEGFR结合，2）此过程持续至少2小时；以及3）CTR1未与VEGFR1或VEGFR3结合（图B）。双分子荧光互补（bimolecular fluorescent complimentary，BiFC）实验结果显示，共转染表达CTR1的Venus-N端载体（Venus-N-terminal vector expressing CTR1，CTR1-VN）和表达VEGFR2的Venus-C端载体（Venus-C-terminal vector expressing VEGFR2，VEGFR2-VC）诱导VEGF刺激的细胞中黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）发出荧光（图C），表明为应对VEGF，CTR1与VEGFR2直接相互作用。免疫荧光共定位分析（immunofluorescence co-localization analysis）的结果显示，在基础状态下，部分CTR1和VEGFR2共定位于质膜，而VEGF刺激促进CTR1和VEGFR2与Rab5/EEA1阳性的早期核内体向核周区域共内化（图D1&D2）。因此，VEGF刺激迅速促进CTR1与VEGFR2结合，以及CTR1/VEGFR2与早期核内体共内化，最终激活内皮细胞中的VEGFR2下游信号。细胞表面生物素化实验（图5E）、co-IP（图5F）和共定位分析（图5G）结果显示，对比于CTR1-WT或 CTR1-H190A，在转染CTR1-C189A的EC中，VEGF诱导CTR1和VEGFR2的内化、共定位或相互结合几乎完全被抑制。因此，VEGF诱导CTR1-Cys189OH对形成CTR1-VEGFR2复合物十分重要，从而促进其共内化。
5. 体内实验明确mCTR1-C187A KI降低小鼠血管生成
与WT视网膜相比，mCtrlKI/KI视网膜表现为：1）血管丛延迟向外周延伸，2）血管长度降低，以及3）出芽式血管分支点、顶端细胞和丝状足的数量显著减少（图A）。主动脉环实验（aortic ring assay）的结果显示，对比于WT小鼠，mCtr1KI/KI小鼠的主动脉中，VEGF诱导的芽生式血管显著减少（图B）。此外，将腺病毒 VEGF-A164（Ad-VEGF）注射入耳朵后，与WT小鼠对比，mCtr1KI/KI小鼠中VEGF诱导的耳朵血管量显著降低（图C）。
CTR1在Cys189区巯基氧化，其连接Cu转运蛋白、ROS依赖的VEGFR2信号通路和血管生成。在EC中，VEGF诱导CTR1-Cys189OH形成，以Cu转运不依赖的方式磷酸化MEK1/2和ERK1/2。相比之下，Cys氧化缺陷的CTR1-C189A抑制VEGF诱导的MAPK信号通路，而不会影响CuCl2或生长因子诱导的效应。此外，Cu/成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）/胰岛素诱导的ERK活化作用依赖于CTR1进行Cu转运，但不依赖于CTR1 Cys189进行氧化还原传感。CTR1激活MAPK不依赖Cu转运，是VEGF特异的。而细胞表面的CTR1激活Cu吸收-LOX轴依赖的血管生成反应。另外，氧化还原依赖的CTR1修饰促进Cu入胞不依赖的VEGFR2信号激活和典型的Cu入胞依赖的铜依赖酶激活，从而增强EC的血管生成反应。综上所述，以Cys氧化依赖和不依赖的方式，VEGF和Cu诱导的CTR1内吞作用发生，该内吞作用促进血管生成并预防Cu毒性。
基于细胞实验和动物实验，作者得出结论——铜转运蛋白的半胱氨酸氧化促进VEGFR2信号通路及血管生成，这极有利于治疗血管生成依赖的疾病。然而，由于未展开临床实验，所以无法确认此份研究报告是否有助于改善疾病患者的状态。此外，血管异常增生的疾病包括肿瘤、月经失调、视网膜病、牛皮癣、血管瘤、糖尿病类和风湿性关节炎，而血管新生抑制的疾病囊括心肌梗死后、脑梗塞后、冠心病和血管闭塞性血栓性脉管炎。例如，肿瘤依赖于血管生长和转移，因而以血管生成为靶点，有利于治疗癌症。所以，CTR1/Cys氧化/VEGFR2信号/血管生成通路与各类疾病的关系值得进一步研究。
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