高分的转录组 代谢组文章，除了分析思路新颖，可以找到关键的新基因或新的转录因子之外，找到基因之后，有没有系统的，全面的基因功能验证方案也是决定文章影响因子好坏的重要指标。
那么基因验证工作有很多，如何根据不同的目的去筛选不同的验证方法呢。我们先来看下基因验证有哪些分类：
🔵 第一类，基因表达量的验证。候选基因表达量的验证，目的是确定该基因在特定组织（细胞）中的表达量与对照组织（细胞）有差异。
🔵 第二类，基因位置定位。确定基因的位置，是核基因还是膜基因或者细胞器基因等。
🔵 第三类，候选基因功能验证。将基因进行敲除（敲低）、过表达，或进行功能回复实验，确定该基因的差异表达与生理或病理状态相关。
🔵 第四类：基因调控机制验证。互作验证，研究 RNA与RNA或RNA与蛋白之间如何作用、调控，最终导致功能改变。
#1
定性定量验证
1.荧光定量核酸扩增检测（Real-time Quantitative PCR Detecting System，qPCR）
qPCR技术是目前最为常见而且必须的高通量测序的验证方法。目前广泛用于转录组测序后的候选基因的定性定量研究。转录组测序作为最常见的二代测序技术[1]，进行定性定量研究时依靠生物信息分析计算出多基因的表达量，会存在一定的误差，而qPCR是检测特定基因表达丰度，特异性更高。
qPCR验证流程：
#2
基因位置定位
亚细胞定位是查找基因或蛋白质在细胞内的具体存在的位置，如在核内、胞质内或者细胞膜上存在。常见的亚细胞定位方法有生物信息学预测法、免疫荧光法、GFP融合蛋白表达法。
1.免疫荧光法
免疫荧光法（Immunofluorescence method）是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位。
图1.免疫荧光原理示意图
2.GFP融合蛋白表达法
GFP是绿色荧光蛋白，在扫描共聚焦显微镜的激光照射下会发出绿色荧光，从而可以精确地定位蛋白质的位置。绿色萤光蛋白（GFP）是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光。通过基因工程技术，绿色萤光蛋白(GFP)基因能转进不同物种的基因组，在后代中持续表达，并且能根据启动子特异性地表达。使用GFP必须构建融合蛋白载体，并在转染之后有效表达。这样，若在荧光显微镜下看到细胞内某一部位存在GFP信号，说明和GFP融合的蛋白也存在于该部位，这样就达到了确定某物质亚细胞定位的目的。
GFP融合蛋白表达实验流程：
图2.GFP融合蛋白亚细胞定位结果展示
#3
功能验证
1.基因过表达验证
通过人工构建的方式在目的基因上游加入调控元件，使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，从而实现基因产物的过表达。
应用：mRNA，lncRNA，miRNA等功能验证。
验证流程：
2.基因功能缺失(Loss of function)研究
包括敲除（knock out）、RNAi技术和基因编辑技术，敲除（敲低）目的基因。使用RNA干扰（RNAi）、CRISPR/Cas9、T-DNA插入等方法敲除（敲低）目的基因，同时观察表型和功能变化。
1）RNAi方法
dsRNA进入胞质后，核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个小RNA（大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链，由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-inducedsilencing complex，RISC)。RISC具有核酸酶的功能，与mRNA进行特异性结合并切割mRNA。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。另，shRNA（shorthairpin RNA，短发夹RNA）可被加工为siRNA，还存在另外一种小分子RNA（microRNA，miRNA）也能引起RNAi现象。
验证流程：
CRISPR/Cas（Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats）CRISPR/Cas是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制，其主要功能是对抗入侵的病毒及外源DNA。在这一系统中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列的靶定位点剪切双链DNA，从而达到对基因组DNA进行修饰的目的。
3.回复实验
过表达的同时敲除（敲低）目的基因，或者是在敲除（敲低）的基础上过表达目的基因，观察表型和功能是否回复。
图3.回复实验结果展示
4.酶活验证
通过将目的基因转入载体，诱导其表达获得有功能活性的蛋白，并构建含有该蛋白和底物的反应体系进行反应，以验证蛋白是否具有催化作用。体外酶活验证通常用来帮助鉴定基因/蛋白功能、专一性等，也可帮助构建代谢通路。在转录组 代谢组发现候选基因与代谢物后，可选择酶活验证方法，来验证候选代谢物是否为后续基因的底物，及是否可以生成预期代谢产物。
酶活验证流程：
#4
相互作用的研究方法
相互作用研究和验证包括CoIP、ChIP、RIP、RNAFISH、EMSA，酵母单杂，双荧光素报告酶系统检测等。可以验证RNA与蛋白，及转录因子与基因启动子的相互作用关系。
1.双荧光素酶报告系统
荧光素酶报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase) 活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在荧光n氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪或液闪测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。
双荧光素酶实验流程：
2.RNA pull-down
RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用或质谱实验检测特定的RNA结合蛋白的蛋白类型。可用于研究LncRNA或CircRNA与蛋白的互作。
3.RIP
免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是研究蛋白与其他大分子互作的关键技术之一，研究蛋白与蛋白互作称为Co-IP，蛋白与RNA互作称为RIP，蛋白与DNA互作称为ChIP。基本原理是将研究目的蛋白的抗体进行免疫共沉淀，接下来根据要检测的分子类型通过各种方法进行检测。
RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation）主要侧重于蛋白质- RNA相互作用。主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。
RNA pull-down和RIP一个侧重于验证蛋白质，一个侧重于验证RNA，两者的结果可以相互印证。
图4.RNA pull down（左）与 RIP-PCR（右）原理示意图
4.凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）
是检测蛋白质和核酸序列（DNA或RNA）相互结合的技术。蛋白与 DNA（RNA）结合形成的复合物由于分子量大，在电泳过程中迁移较慢，出现不同位置的条带。
图5.EMSA实验结果图
5.酵母单杂交系统
酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合，调控报道基因表达的原理克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是:许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD)组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子。
图5.酵母单杂流程图
6.酵母双杂交系统的原理
酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域基因和转录激活因子（如GAL4等）激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。由于蛋白质直接互作是蛋白质发挥调控作用的重要方式，如果要研究某个基因行驶某功能，可以将这个基因和靶基因都整合到酵母中进行互作研究，从而分析其功能。
图6.酵母双杂交原理示意图
参考文献：
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[5] Prensner J R, Iyer M K, Balbin O A, et al. Transcriptome Sequencing Identifies PCAT-1, a Novel lincRNA Implicated in Prostate Cancer Progression[J]. Nature Biotechnology, 2011, 29(8):742.
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