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研究背景
（1）肾透明细胞癌 （ccRCC） 是肾细胞癌最常见和最具侵袭性的组织学亚型，目前ccRCC临床治疗方式（包括常规化疗、靶向治疗和免疫治疗）的疗效受到肿瘤异质性的限制，需要了解潜在的细胞和分子机制，以促进生物标志物的发现并指导临床干预。
（2）ScRNA-seq已被用于全面表征ccRCC的细胞组成和转录状态，揭示其起源和肿瘤内异质性，尚不清楚顺式作用DNA元件（例如，增强子和启动子）和反式作用因子（例如，转录因子（TF））如何调节微环境中的这些变化。
（3）ScATAC-seq 通过 Tn5 转座酶介导的标记识别可访问的染色质区域，并以单细胞水平的分辨率捕获活性 DNA 调控元件，与批量ATAC-seq类似，这种方法可以捕获多种类型的基因调控信息;例如，可以识别全基因组顺式作用元件，并指示TFs和有助于其活性的推断。ScATAC-seq已被广泛用于描绘发育谱系的分化轨迹并揭示关键调控要素。
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数据来源和研究方法
（1）数据来源：
1. 从Broad Institute GDAC Firehose得到来自肾透明细胞癌的TCGA RNA-seq数据和临床信息。
2. 抗PD-1治疗ccRCC的标准化数据是从先前的研究中获得的。
3. 三个scATAC-seq数据和四个scRNA-seq数据来源于作者提供的数据资料。
（2）研究方法：
1. 从肾透明细胞癌scRNA-seq和scATAC-seq数据集中通过降维，聚类，差异表达分析，为了解释scRNA-seq数据，对两个数据集进行综合分析，scATAC-seq基因活性和scRNA-seq基因表达之间的共享相关模式由“FindTransferAnchors”函数识别，然后通过“TransferData”函数预测scATAC-seq数据中每个细胞的细胞类型标签，经过过滤、批次校正后用SLM算法聚类。
2. 通过inferCNV估计潜在肿瘤细胞群的CNV。
3. 通过Signac中的RunChromVAR推断单细胞转录因子活性结构域。
4. 通过一系列过滤鉴定出肿瘤特异性转录因子。
5. 鉴定出TF候选靶基因，利用igraph包用这些TF基因去构建细胞类型特异性TF调控网络。
6. 使用来自LINCS联盟的药物扰动谱筛选可靶向 TF 的候选药物。
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结果
1.ccRCC中的单细胞转录和染色质可及性分析
作者首先ccRCC的单细胞RNA测序数据和ATAC测序数据进行聚类分析
图1
1）对于scATAC-seq数据Seurat的label-transfer算法和有监督方式注释细胞（图 1d)
2）通过结合这两个注释结果在scATAC-seq数据集中鉴定了12种细胞类型（图）1e， f)
3）通过典型标记基因CA9和和经典拷贝数变异 （CNV）（染色体 3p 丢失或染色体 5q 增加）来鉴定肿瘤细胞（图1c， f， g）
4）免疫细胞是数量最多的细胞群，占总细胞的70%以上，而肿瘤细胞占群体的<10%（图h）
2.ccRCC中的肿瘤特异性调控元件
作者为了研究所有细胞类型染色质可及性的差异，我们首先使用MACS212在scATAC-seq数据中对每种细胞类型的染色体可及性进行分析
图2
1）从212362个scATAC-seq 差异峰中发现10.6%在细胞类型之间表现出显著差异，这些位点被定义为差异可及染色质区域（DAR）（图2a)
2）大多数DAR位于基因组的启动子和内含子区域，并且DARs的分布在细胞类型中相对保守（图2b）
4）差异TF的分层聚类揭示了不同细胞类型之间共享且独特的调控元件（图2d）
5）选择仅在肿瘤细胞中高度富集的TFs并鉴定出49个TFs在肿瘤细胞中的活性评分显著高于任何其他细胞类型（图2e)
6）然后检查了这些肿瘤特异性TFs在TCGA队列中与患者预后的关联，肿瘤特异性TFs平均表达高的患者总生存期和无病生存期比平均表达低的患者短（图2f）
图3
1）为了进一步研究和验证这些TFs在ccRCC中的生物学功能，选择了四种TFs（HOXC5，VENTX，ISL1和OTP），其表达水平与TCGA-KIRC数据集中较差的总生存期显著相关（图3a)
2）为进一步了解TF介导的肿瘤细胞基因调控，构建了TF调控网络，发现这四个TF调节多个肿瘤特异性基因在肿瘤细胞中的表达显著增加（图3b)
3) 进行实验验证，敲低这些TF显著减少了肿瘤细胞增殖并增加了细胞死亡（图3c,d）
4) 寻找靶向这些TFs的潜在药物，发现FDA批准的两种候选药物（高三尖杉酯碱（HHT）和米妥坦）可以显著降低HOXC5，ISL1和VENTX的表达水平（图3e)
5) 实验验证，两种药物都显著降低了肿瘤细胞的增殖率以及两种肾癌细胞系中HOXC5，ISL1和VENTX的表达水平（图3f-j）
3.ccRCC内的恶性转录程序
图4
1） 成对相关性分析揭示了这些肿瘤中始终存在的多种不同的转录状态（图4a）。
2) 为了更精确地了解肿瘤的异质性信息，我们应用非负基质分解（NMF）来定义了11个肿瘤内程序，又通过分层聚类确定了两个元程序，它们在四个样本中包含了高度相似的程序（图4b)
3) 通过通路富集分析研究了这些元程序的生物学功能（图4c)
4) TCGA-KIRC队列中每个元程序的平均基因表达与患者预后之间的关联(图4d,e)
5) 进一步探讨了元程序与之前发现的四种肿瘤特异性TF之间的调控关系。在元程序1中，四个TF都表现出与VEGFA的作用关系，在元程序2中，肿瘤细胞中的DEGCRYAB由所有四个TF调节（图4f,g)
4.ccRCC中的CD8 T细胞聚类分析
作者接下来为了更好地阐明肿瘤浸润CD8 T细胞的异质性，进一步研究了scRNA-seq和scATAC-seq数据集中的CD8 T细胞亚群。
图5
1）在scRNA-seq数据集中确定了四个主要细胞簇，在scATAC-seq数据集中确定了五个主要细胞簇（图5a,b)
2) 在scRNA-seq和scATAC-seq数据集中基因表达或功能标记的热图（图5c）
3) 使用多个功能基因集进一步研究了这些CD8 T细胞亚群的功能特性, 衰竭集群呈现最高的细胞毒性、衰竭和终末分化特征评分（图5d,e)
4) 评估了每个CD8 T细胞簇的祖细胞和终末耗尽的特征分数, 发现组织驻留的C1簇具有最高的祖细胞特征评分和最低的终末耗尽特征评分（图5f）
5) 通路富集分析，发现两个组织驻留簇富集了不同的途径：组织驻留的C1簇与炎症反应显著相关，组织驻留的C2簇富集了细胞因子和维生素代谢途径（图5g)
6) 接下来，检查了这些CD8 T簇中的TF的富集分数。发现EOMES和BATF与CD8 T细胞耗竭有关，在耗尽簇中高度富集（图5h）
5.ccRCC中的巨噬细胞聚类分析
作者进一步探讨肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的异质性
图6
1）进行了类似于CD8 T细胞的聚类分析，并使用已知的表型标记在两个数据集中鉴定了三个TAM簇。（图6a-c）
2）每个TAM簇中MHC分子，趋化因子，细胞因子和其他相关基因的表达热图。（图6d）
3）为了了解这些TAM亚群的功能，进一步检查了多个功能基因集的表达或活性，发现TAM-RGCC簇表现出最高的M1特征分数，其次是TAM-C1QB簇（图6e)
4）TAM-RGCC簇具有较高的血管生成特征评分,TAM-C1QB簇在scRNA-seq数据中显示出最高的吞噬特征评分，表明吞噬活性高。（图f-g）
5）检查了免疫检查点基因和共刺激分子的表达，在TAM-C1QB和TAM-RGCC簇中均检测到多个共刺激信号，但在TAM-LGALS3簇中未检测到（图6h)
6） 探索了TF基序活性的差异，并在6个TAM簇中发现了不同的TF调控程序，四个TF（MEF1C，NFKB3，RUNX1和ENO）在相应簇中的基因表达和活性均显著增加（图6i）
7）因为MEF2C在促进M1巨噬细胞极化和诱导巨噬细胞细胞死亡方面起着至关重要的作用，鉴定了MEF2C靶基因，发现该基因调节多种TF（例如，FOXO1，NEU1和NRP1）和趋化因子（例如，CCL3和CCL3L1）（图6j）
6.ccRCC微环境中的细胞间串扰
接着作者为了探索ccRCC微环境中的细胞间通讯，应用已知配体 - 受体相互作用的存储库CellPhoneDB进行数据分析。
图7
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文章讨论
本文整合scRNA-seq和scATAC-seq来描绘ccRCC的转录和表观遗传景观。我们的分析表明，scRNA-seq和scATAC-seq具有持续的高细胞识别能力，并且它们的数据相互证实和补充。单细胞多组学谱可以从不同角度提供更全面的信息，使我们能够更好地剖析细胞组成并破译TME中的跨区室相互作用。
写在后面
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