2022年12月19日，浙江大学梁廷波团队在PNAS上在线发表题为“Gut flora disequilibrium promotes the initiation of liver cancer by modulating tryptophan metabolism and up-regulating SREBP2”的研究论文，该研究采用流体动力学转染致癌基因诱导小鼠肝癌，探讨肝癌的发生机制。肠道菌群耗竭促进肝脏肿瘤发生，但未促进其进展。在肠道菌群失衡的小鼠中可观察到固醇调节元件结合蛋白2 (SREBP2)升高。SREBP2或Srebf2 RNA干扰的药理学抑制可减弱肠道菌群失衡下小鼠肝癌的起始作用。此外，肠道微生物群的减少会损害肠道色氨酸代谢，从而激活芳香烃受体(AhR)。AhR激动剂Ficz可在翻译后抑制SREBP2并逆转小鼠肿瘤的发生。此外，AhR基因敲除小鼠肝脏肿瘤发生明显加速。补充产生色氨酸代谢物的罗伊氏乳杆菌可以抑制肠道菌群失衡小鼠SREBP2的表达和肿瘤的发生。迈维代谢为本研究提供色氨酸靶向代谢组学检测和16S测序。
1.肠道菌群失衡促进了小鼠肝肿瘤的发生
为了确定肠道共生细菌在肝肿瘤发生中的作用，在饮用水中向小鼠给予抗生素混合物(ABX)(万古霉素、新霉素和氨苄青霉素)，以减少肠道共生细菌。在ABX处理14天后，首先通过16S rRNA测序检查了粪便细菌群落的变化。在门水平，拟杆菌属和厚壁菌属的相对丰度显著降低，在ABX处理后，变形菌占细菌总数的绝大多数。乳杆菌属在正常小鼠中占细菌的第二，在ABX处理的小鼠中显著减少。
并且，肠乳酸杆菌代表了对照组和ABX组之间显著减少的乳酸杆菌种类。通过人c-Myc和n-RAS (Ras/Myc)两种癌基因的共转染构建水动力尾静脉注射(HTVi)诱导的HCC模型，在ABX处理后2周进行，并在6周处死小鼠进行表型分析(图1A)。通过分析肝脏重量/体重(LW/BW)比、肿瘤数量和脾脏重量/体重(SW/BW)比以及H&E和Ki67的组织学染色评估肿瘤负荷。当肿瘤结节发展4周(图1 B和C)或短至2周和3周时，ABX处理显著加快了Ras/Myc诱导的肝肿瘤开始。小鼠存活分析显示，在通过Ras/Myc转染引发肿瘤后，与对照小鼠相比，ABX处理的小鼠具有显著更短的平均存活时间(图1D)。还检测了短期肠道微生物群耗竭是否会导致肿瘤发生的差异。结果显示，如果早期(HTVi后1周)停止ABX处理，则效果相似。
为了进一步证实这一表型，还应用了其他肝肿瘤模型。在肠道微生物群耗竭2周后，用人c-Met和人β-Catenin癌基因转染小鼠，并在6周时将其杀死(图1E)。肉眼和组织学检查观察到与ABX处理相同的效果。在接受ABX处理的小鼠中还观察到LW/BW比值、肿瘤数量和SW/BW比值增加(图1 F和G)。为了排除ABX处理诱导的低LW/BW比(对照小鼠中为92.97%)对肿瘤起始的影响，向ABX处理的小鼠给予了HTVi给予对照小鼠的90%的体积，在肠道微生物群耗竭的小鼠中仍观察到显著增加的肿瘤负荷。进一步通过两种癌基因，人Yes相关蛋白(YAP)和丝氨酸/苏氨酸激酶AKT (YAP/AKT)的共转染建立了肝内胆管癌(ICC)模型，以研究肠道微生物群是否也影响ICC的启动。与HCC小鼠模型一致，与对照组小鼠相比，ABX处理也显著加快了ICC的启动。
为了进一步评估肠道微生物群在肝肿瘤发生中的作用，使用无菌(GF)小鼠使肠道微生物群完全衰竭。在第8周处死的GF和正常无特定病原体(SPF)小鼠中进行了HTVi (Ras/Myc)试验。与ABX处理一致，与SPF小鼠相比，GF小鼠表现出明显更快的肿瘤形成，LW/BW比、肿瘤数量和SW/BW比增加。此外进行粪便微生物群移植(FMT)，以研究来自正常SPF小鼠的粪便微生物群是否能减缓GF小鼠中肝肿瘤的发生(图1H)。16S rRNA测序和恢复的盲肠大小证实，来自SPF小鼠的粪便微生物群已在GF FMT小鼠中成功定殖。FMT抑制了GF小鼠中增加的肿瘤形成，包括降低的LW/BW比、降低的肿瘤数和降低的SW/BW比(图1 I和J)。总之，这些发现表明肠道共生微生物群抑制小鼠肝肿瘤的发生。
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图1 肠道共生菌耗竭促进小鼠肝肿瘤的发生
2.肠道菌群失衡未能影响小鼠的肿瘤进展和转移
越来越多的证据表明，细菌微生物群在促进HCC病的发展中起着关键作用。因此使用HTVi诱导的肝癌模型来探讨肠道共生菌在肝肿瘤进展中的作用。当肝表面有肉眼可见的微小肿瘤时，在HTVi后2周给予ABX处理(Ras/Myc)，在HTVi后6周处死小鼠(图2A)。结果表明，肿瘤起始后，小鼠肠道共栖细菌的耗竭非但没有促进肿瘤的发展，反而导致肿瘤数量略有减少，LW/BW比值和SW/BW比值呈下降趋势(图2 B和图2c)。
还探讨了肠道菌群失衡在肝癌转移和其他类型的肝转移癌中的作用。使用了皮下植入的肿瘤模型(Hep1-6，一种小鼠HCC细胞系)(图2D)，并发现ABX处理的小鼠和对照小鼠之间的肿瘤重量和肿瘤体积没有差异(图2 E和F)。为建立肝转移模型，脾内注射KrasLSL-G12D、Trp53LSL-R172H、Pdx1-Cre(KPC)胰腺肿瘤细胞(图2G)，ABX处理小鼠与对照组小鼠之间的肝转移无差异(图2H和I)。外周注射Hep1-6细胞诱导的肝癌肺转移也有同样的结果(图2j-L)。总之，与肝癌发生相反，肠道菌群失衡未能影响小鼠的肿瘤进展和转移。
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图2 小鼠中共生细菌耗竭不会加速肝肿瘤进展
3.肠道菌群失衡导致肝脏中SREBP2和下游胆固醇合成相关基因表达增加
肠道共生细菌在肝癌发生和发展中的不同作用促使探索肝脏肿瘤发生的关键驱动基因。分离来自ABX处理的小鼠和对照小鼠的肝组织(图3A)，并进行转录组分析。与对照小鼠相比，在接受ABX处理的小鼠的肝脏中鉴定出114个上调基因和114个下调基因(图3B)。GO-Biological Process分析显示胆固醇代谢相关过程富集(图3C)。Reactome数据库中的途径富集分析还显示，在肠道共生细菌耗竭的小鼠中，“类固醇代谢”和“胆固醇生物合成”途径上调(图3D)。
实际上，从转录组分析来看，ABX处理后，肝脏中参与胆固醇生物合成的许多基因的表达水平上调(图3E)。然后，进行实时qRT-PCR和WB，以分别验证一些关键的胆固醇生物合成相关基因和蛋白，这些基因和蛋白在ABX处理小鼠的肝脏中大多上调(图3 F和G)，这也与它们在GF小鼠的肝脏中的表达一致。其中，转录因子SREBP2(由Srebf2编码)被认为是控制许多下游胆固醇生物合成相关基因表达的关键。然而，在接受ABX处理的小鼠的肝脏中或在GF小鼠中，Srebf2的mRNA表达没有改变。
然后验证了在ABX耗竭小鼠和GF小鼠中，SREBP2在肝脏中的蛋白水平是否上调。在ABX处理小鼠的肝脏中，SREBP2前体形式(p-SREBP2)和SREBP2核形式(n-SREBP2)的蛋白水平均显著升高(图3G)。在GF小鼠中观察到了相同的结果。此外，还测量了血清和肝样本中的胆固醇和甘油三酯(TG)。ABX处理小鼠的血清和肝脏中胆固醇浓度显著升高，而TG浓度在两组之间无显著差异(图3H)。此外，肝功能测量显示，ABX处理对小鼠肝脏无毒性作用(图3I)。总之，肠道菌群失衡导致肝脏中SREBP2和胆固醇合成相关基因表达增加，这被认为是促进肝癌发生的关键因素。
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图3 在肠道共生细菌耗竭的小鼠中，SREBP2和下游胆固醇合成相关基因表达增加
4.肝脏SREBP2升高促进肠道菌群失调小鼠的肝肿瘤发生
然后试图阐明胆固醇合成代谢的增强是否在肝肿瘤的发生中起关键作用。关于胆固醇代谢在癌症进展中的影响的研究强调了胆固醇代谢物对肿瘤免疫微环境的重要影响。然而，在本研究中，流式细胞术分析显示，在用ABX处理的小鼠的肝脏或脾脏中，各种免疫细胞的浸润没有显著差异。还评估了用ABX处理的免疫缺陷小鼠的肝肿瘤发生情况。表型分析显示，在裸鼠中，由ABX处理诱导的肠道菌群失衡也可促进HTVi (Ras/Myc)诱导的肝癌形成。
而且，由于ABX处理的小鼠血清和肝脏中胆固醇水平升高，研究了胆固醇升高是否直接加速了肿瘤的发生。在HTVi (Ras/Myc)之前，小鼠接受高胆固醇饮食(HCD，2%胆固醇)2周，以提高血液和肝脏中的胆固醇水平。结果显示，与对照饮食喂养的小鼠相比，用HCD喂养的小鼠没有表现出增加的肿瘤负荷。因此得出结论，在肠道菌群失调的小鼠中，胆固醇水平的变化不是驱动肝肿瘤发生的关键机制。
在肿瘤发生过程中，据报道SREBP2在某些类型的肿瘤中可能是一种致癌基因。因此研究了肝脏SREBP2增加是否是肠道微生物群耗竭小鼠肿瘤加速启动的原因。将白桦脂醇(一种阻断SREBP切割激活蛋白/SREBP途径的SREBP抑制剂)给予用H2O或ABX处理的小鼠(图4A)。验证实验表明，在ABX处理的小鼠中，14 d的桦木醇处理有效地抑制了肝n-SREBP2水平(图4B)。桦木醇处理未能降低对照小鼠中的肿瘤负荷，但导致喂食ABX的小鼠中的肿瘤负荷显著降低(图4 C和D)。然后使用编码Srebf2-RNA干扰(AAV8-Srebf2 KD)的腺相关病毒8 (AAV8)敲除肝脏Srebf2表达。向小鼠注射AAV8-Srebf2 KD或AAV8-EGFP (AAV8-Vector，作为对照)，4周后进行HTVi (Ras/Myc)(图4E)。验证实验显示，在接受ABX处理的小鼠中，注射AAV8-Srebf2 KD显著降低了Srebf2表达，p-SREBP2和n-SREBP2水平均显著降低(图4F)。
该表型显示，肝脏Srebf2敲除再现了桦木醇治疗的挽救效应，该效应显著抑制了ABX处理小鼠的肿瘤发生(图4 G和H)。相比之下，还在正常小鼠中注射表达Srebf2的AAV 8(AAV 8-srebf 2 OE)以过表达肝脏SREBP2，并在4周后进行HTVi (Ras/Myc)(图4I)。验证实验显示，在注射AAV8-Srebf2 OE的小鼠中，Srebf2表达以及p-SREBP2和n-SREBP2水平均显著升高(图4J)。与对照组小鼠相比，肝脏中SREBP2过表达显著增加了肿瘤负荷(图4 K和L)。因此得出结论，肠道菌群失衡诱导的SREBP2在肝脏中的过表达直接促进了肝肿瘤的发生。
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图4 肝脏SREBP2升高促进肠道共栖细菌减少小鼠的肿瘤发生
5.肠道菌群失调减少微生物来源的AhR配体促进小鼠肝脏肿瘤的发生
接下来尝试探索肠道菌群失衡与SREBP2调节的肝脏胆固醇合成变化之间的关系。肠道微生物群中的色氨酸代谢及其代谢产物AhR的传感器作为连接肠道菌群失调与肝病的重要桥梁而被广泛研究。一般来说，肠道色氨酸可被色氨酸酶阳性细菌(尤其是大肠杆菌和乳杆菌)代谢为吲哚，并进一步转化为更多的衍生物，如吲哚-3-乙酸(IAA)，它们是AhR的配体。考虑到ABX处理导致肠道菌群组成发生变化，首先探讨了肠道共生菌耗竭对肠道AhR配体的影响。因此使用LC-MS/MS检测了色氨酸及其代谢产物，在接受ABX处理的小鼠粪便中检测到23种代谢产物，包括不存在5-羟基色氨酸、吲哚-3-β-丙烯酸和色胺(低于1 ng/g)(图5 A和B)。实际上，在接受ABX处理的小鼠中，10种色氨酸代谢产物(包括IAA的AhR配体、吲哚-3-甲醛(ICAld)和吲哚-3-丙酸)的水平显著降低(图5C)。
据报道，AhR以不依赖二恶英反应元件的方式调节胆固醇生物合成，并调节肝脏中的SREBP2。因此推测肠道共栖细菌的减少AhR配体减少会影响肝脏中的SREBP2水平。为了测试这一假设，将AhR激动剂6-甲酰基吲哚(3，2-b)咔唑(Ficz)施用给ABX处理的小鼠和对照小鼠(图5D)。与对照组小鼠相比，AhR的靶基因Cyp1a1的表达在ABX处理的小鼠中显著降低，与SPF小鼠相比，其在GF小鼠中也降低，这表明肠道菌群失调的小鼠中AhR活性受损。并且，在对照组和ABX组中，Cyp1a1在Fic处理后显著升高(图5E)。
值得注意的是，在Ficz相同处理下，ABX处理小鼠的Cyp1a1水平低于对照组小鼠。蛋白质印迹结果显示，施用Ficz显著降低了p-SREBP2和n-SREBP2的蛋白水平，同时降低了下游HMGCR的表达，HMG Cr是ABX处理的小鼠中胆固醇生物合成的限速酶，但在对照组小鼠中没有降低(图5F)。表型分析显示，施用Ficz显著抑制了ABX处理的小鼠中的肿瘤负荷，但没有抑制对照小鼠中的肿瘤负荷(图5 G和H)。进一步在用AAV8-Srebf2 OE转染的小鼠中施用Ficz来验证这一假设。值得注意的是，对照小鼠肝脏中Ficz诱导的Cyp1a1过表达显著高于SREBP2过表达小鼠的肝脏中的cyp1a 1过表达，并且在SREBP2过表达条件下，Ficz处理显著降低了SREBP2的蛋白水平。因此得出结论，在肠道菌群失调的小鼠中，色氨酸代谢产生的AhR配体减少了AhR的激活，最终上调SREBP2，促进肝脏肿瘤的发生。
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图5 肠道菌群失衡通过上调SREBP2，减少微生物群来源的AhR配体以促进小鼠肝肿瘤发生
然后使用Ahr敲除(AhR/)小鼠进一步确认受损的AhR活化是否会直接升高肠道菌群失衡小鼠的SREBP2。与对照组小鼠相比，Ahr小鼠的p-SREBP2和n-SREBP2水平均显著升高，同时伴有下游HMGCR表达升高(图6A)。接下来在Ahr和对照小鼠中进行了HTVi (Ras/Myc)，并在HTVi后24 d处死小鼠进行表型分析。与对照组小鼠相比，Ahr小鼠的肿瘤负荷显著增加(图6 B和C)。
接下来对用ABX(Ahr/-ABX)处理的Ahr/小鼠和用ABX (WT-ABX)处理的对照小鼠给予Ficz，以进一步证实Ficz抑制SREBP2和肿瘤发生的作用可归因于Ahr活化，而不是Ficz的其他作用(图6D)。与之前的观察结果一致，在WT-ABX小鼠中，p-SREBP2和n-SREBP2水平均被Ficz抑制，并伴有HMGCR表达下降，而在Ahr/-ABX小鼠中，Ficz未能抑制肝脏SREBP2和下游HMGCR表达(图6E)。表型分析也证实Ficz未能降低Ahr/-ABX小鼠的肿瘤负荷(图6 F和G)。总体而言，这些结果进一步证实，AhR可抑制小鼠肝脏SREBP2水平并减弱肿瘤发生。
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图6 Ahr-/-小鼠表现出肝脏SREBP2表达增加和肿瘤发生加速
6.罗伊乳酸杆菌对肠道菌群失调小鼠肝脏肿瘤的抑制作用
接下来研究了补充色氨酸酶阳性细菌是否可以减少肠道菌群失调小鼠的肝脏SREBP2和肿瘤发生。根据16S rRNA测序结果，乳酸杆菌代表了在ABX处理小鼠中显著减少的细菌的第二大比例。并且，据报道，罗伊乳酸杆菌具有很强的代谢色氨酸的能力，并表现出高的AhR配体产量。
因此，在ABX处理13天后，每隔一天施用罗伊乳酸杆菌或乳酸菌培养物(MRS)培养基，1天后，进行HTVi (Ras/Myc )(图7A)。HTVi前收集各组大鼠粪便，检测粪便中色氨酸及其代谢产物。主成分分析显示，与对照组小鼠相比，在肠道菌群失调的小鼠中施用罗伊乳酸杆菌产生了相似的色氨酸代谢物(图7B)。在肠道菌群失调的小鼠中施用罗伊乳酸杆菌后，鉴定了所有检测到的色氨酸代谢物，并且六种代谢物显著增加，其中IAA和ICAld是AhR的配体(图7 C和D)。在肝脏中，施用罗伊乳酸杆菌显著降低了肠道菌群失调小鼠中p-SREBP2和n-SREBP2的蛋白水平(图7E)。在HTVi (Ras/Myc)后4周处死小鼠，表型分析显示施用路氏乳杆菌显著减弱了肠道菌群失调小鼠的肿瘤形成(图7F)。在肠道菌群失调的小鼠中，补充罗伊乳酸杆菌后，肿瘤负荷显著降低(图7G)。
进一步将罗伊乳酸杆菌施用于Ahr−/−-ABX和WT-ABX小鼠，以证实罗伊乳酸杆菌抑制SREBP2和肿瘤发生的作用归因于Ahr激活。在Ahr−/−-ABX小鼠中，罗伊乳酸杆菌未能抑制肝脏SREBP2表达和肿瘤发生。总的来说，这些结果表明，补充罗伊乳酸杆菌增加了微生物群衍生的AhR配体，这与Ficz处理的效果相似，即在肠道菌群失调的小鼠中，它降低了SREBP2和肿瘤发生。
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图7 在肠道菌群失衡的小鼠中，罗伊乳酸杆菌补充剂增加了微生物群来源的AhR配体并抑制了肿瘤发生
7.在HCC病患者中，粪便IAA水平不足伴有肿瘤性AhR活性降低和SREBP2表达增加
接下来研究了这些发现在人类疾病中的相关性；使用HCC患者和健康受试者的粪便样本检测色氨酸代谢产物和微生物群16S rRNA测序。与健康受试者相比，HCC患者的五种色氨酸代谢产物发生了显著变化，其中IAA和ICAld为AhR配体。HCC患者IAA水平降低，ICAld水平升高。值得注意的是，健康受试者与HCC患者的平均IAA浓度为2022.34 ng/g对1124.50 ng/g，健康受试者与HCC患者的平均ICAld浓度为66.43 ng/g对128.50 ng/g，远低于IAA (SI附录，图S10 A和B)。
此外，据报道，在小鼠和人类中，IAA是主要的AhR激活剂，而不是ICAld。16S rRNA测序显示，与健康受试者相比，在门水平上，HCC患者的厚壁菌门相对丰度降低，变形菌增加。在属水平上，Blautia属代表了HCC组中显著减少的属。进一步检查了Cyp1a1在HCC组织和匹配的邻近非肿瘤组织中的表达，结果显示Cyp1a1在HCC组织中显著降低。还观察到HCC病患者粪便IAA水平与Cyp1a1表达呈正相关。并且，与匹配的邻近非肿瘤组织相比，在HCC组织中观察到SREBP2表达增加。总体而言，这些结果表明，在HCC患者中，粪便IAA减少与HCC组织中AhR活化受损和SREBP2表达增加相关。
在该研究中，研究人员使用流体动力学转染诱导肝癌模型，发现抗生素诱导的肠道菌群失衡显著促进了肝癌的发生和肝脏胆固醇的合成。肠道菌群失衡诱导的肝脏胆固醇代谢与肠道中的色氨酸代谢物及其受体芳香烃受体(AhR)的激活有关。总之，该研究确定了来自肠道菌群的色氨酸代谢物在肝脏中通过AhR信号通路调节SREBP2表达中的作用，这对预防肝脏肿瘤的发生至关重要。该结果为预防肝脏肿瘤的发生提供了新的见解，并可能有助于肝癌预防策略的开发和发展。
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