肿瘤细胞休眠（态）相关概念
肿瘤休眠最早在20世纪40年代由 Wilis等人提出。研究中，科学家们观察到肿瘤细胞有丝分裂周期停滞、细胞增殖抑制。休眠，表现为三种形式：细胞休眠，通过内在的或外在的机制使实体肿瘤细胞或弥散的肿瘤细胞处于沉默状态；血管生成休眠，即肿瘤细胞团块内部，存活的分散的肿瘤细胞与因血管生成不良而死亡的肿瘤细胞之间的平衡 ；免疫介导的休眠，即肿瘤细胞团块内细胞本身分泌的毒素物质的作用使该团块细胞数量保持相对平衡。临床研究表明，散在的单个肿瘤细胞是不具有增殖能力的，因为不能检测到任何细胞增殖相关标记物信息，这可能是细胞休眠的真实表现形式。
Highlights：三阴性乳腺癌细胞从单细胞或微转移状态逃离是脑转移的限速步骤。弥散性肿瘤细胞（DTC）位于星形胶质细胞足突上，星形胶质细胞沉积的层粘连蛋白-211通过诱导肌营养不良蛋白聚糖受体与Yes相关蛋白结合驱动DTC休眠，从而将其与细胞核隔离并阻止其促转移功能。
1. 休眠是乳腺癌脑转移的限速步骤
先前的研究已提出过许多脑转移的限速步骤，包括在脑微血管系统内阻滞后的存活、血脑屏障的外渗以及DTC在“外来”微环境中的持续存在。长期以来，DTC休眠被认为是脑转移的限制步骤。通过将很少形成脑转移的亲代系与同基因的脑转移衍生物直接比较，应用活体成像技术重新探讨这个问题，以准确记录亲代细胞系在哪里受到限制。
该研究使用了两种传播到大脑但很少产生转移的乳腺癌细胞（BCC）系：HMT-3522-T4-2 (T4-2)和MDA-MB-231。两者均为三阴性BCC系（即不表达雌激素和孕激素受体且缺乏HER2）并且与细胞休眠研究相关，因为三阴性乳腺癌（TNBC）现在是乳腺癌脑转移的主要诱因。该研究还使用了T4-2的脑转移亚系（T4-2-BR1）与MDA-MB-231的脑转移系（MDA-MB-231-BR7）。每种细胞都被接种到NOD-SCID小鼠中，并在随后的几周内使用标记物进行跟踪，以通过双光子成像每3-4天记录单个DTC的命运（图 1a）。这种方法最初由Kienast等人建立，使研究者对单个DTC在到达并渗透进入大脑、死亡、休眠或发生转移时进行跟踪。
在两种模型中，到达大脑的多数细胞（903个中的805个）在外渗前或外渗后死亡。亲代T4-2细胞和T4-2-BR1在这方面没有什么不同，两者的血管内死亡或移位率（60.8%；59.7%）和从葡聚糖标记的脉管系统外渗后的任何时间点的死亡率（51.6%；53.8%；图 1f)相似。MDA-MB-231-BR7在这方面与其亲代对应物也没有显着差异，血管内死亡减少11%，外渗后死亡减少10.1%（图1g）。这些细胞系在进入血脑屏障的能力方面也没有显着差异。在追踪的316个T4-2细胞中，39.2%的细胞成功外渗到大脑中，而T4-2-BR1的成功率为40.3%（图 1f）。根据该指标，MDA-MB-231-BR7的表现优于MDA-MB-231，比亲代细胞系的外渗效率高18.3%（图 1g）。然而，这些比率不足以解释用两个亚系观察到的转移增加（图 1d-g）。当观察它们在单细胞（图 1b、c、f、g）或微转移水平上进入和维持休眠的速率时，两对的差异明显更大。脑转移性T4-2s的休眠部分减少了56.6%，而在MDA-MB-231-BR7中没有观察到这种状态（图 1f，g）。T4-2-BR1形成微转移的效率比亲代系高2.39倍（图 1f），而进展到这个状态的MDA-MB-231-BR7的效率比MDA-MB-231高3.34倍（图 1g）。两个细胞系之间最大的区别是它们维持并最终摆脱微转移状态的能力。而几乎所有亲代T4-2和MDA-MB-231在形成微转移时都会消退（意味着它们要么死亡，要么回退到单细胞水平），只有31.2%的T4-2 -BR1和3.4%的MDA-MB-231-BR7微转移符合这种状态（图 1f，g）。类似地，T4-2-BR1和MDA-MB-231-BR7的25%和96.6%能够形成完全转移（图 1d-g）。
这些数据表明，限制脑转移的既不是进入大脑也不是在那里存活，而是维持从单细胞状态逃逸的能力。这强调需要了解DTC和微转移的休眠是如何强制执行的，以及哪些因素导致其减少。
图1. 摆脱休眠状态是乳腺癌脑转移的限速步骤
2. DTC激活后，星形胶质细胞足突从血管中剥离
脑中的血管周围细胞包括星形胶质细胞和周细胞，它们参与分子串扰以诱导内皮紧密连接分子的表达，表现为物理血脑屏障的形成。星形胶质细胞特殊的结构，称为足突，包裹着大脑的微血管，并通过调节水流入和离子浓度的阵列式水通道蛋白4（AQP4）增加屏障功能。AQP4定位于足突的表面，通过肌营养不良蛋白复合物与内皮的外腔表面并列，该复合物与大脑微血管系统周围的两个基底膜中的第二个（血管基底膜是第一个）相连。这种实质基底膜富含星形胶质细胞衍生的糖蛋白、层粘连蛋白-211、-111以及蛋白聚糖集聚蛋白。星形胶质细胞、周细胞、lama2或聚集蛋白的缺失足以破坏星形胶质细胞足突的极化、内皮紧密连接和整体屏障功能。在此背景下，推测研究星形胶质细胞和周细胞在脑转移进展过程中的定位可能会提供有关DTC休眠如何在血管周围生态位中调节的线索。
长期以来，在形态学上已经确定星形胶质细胞从脉管系统中“剥离”并分离到脑转移瘤的边界。作者观察到这种情况发生在转移的早期。与静止（即 Ki67 阴性）T4-2 DTCs相邻的脉管系统被AQP4 足突包裹，在与Ki67阴性微转移相邻的血管中仅观察到边缘的覆盖略微减少（15%）（图 2a-c）。在含有单个Ki67阳性细胞的小微转移灶中，足突覆盖率的显着降低（85%），并且这些结构几乎完全从脑转移灶内的血管中移除（图 2b，c）。该模型中AQP4 足突的丢失与血管周围GFAP 星形胶质细胞的急剧减少相吻合，表明星形胶质细胞驱逐与足突去除同时发生。
因为Pdgfrb 周细胞的缺失破坏了AQP4极化和拟表型足突的去除，作者还测量了在转移进展过程中DTC相关血管的PDGFR-β覆盖率。其与静止DTC、微转移或转移相邻的血管的周细胞覆盖率没有显着差异（图 2d，e）。在MDA-MB-231模型中对转移进展的检查揭示了一个非常相似的现象：在Ki67从阴性转变为阳性后，微转移相关血管的星形胶质细胞足突覆盖减少了79%，但在此阶段周细胞覆盖没有显着减少并且在进展为完全转移后没有进一步加剧周细胞丢失（图2f-i）。
星形胶质细胞足突在维持血脑屏障生理学中的关键作用以及在DTC增殖的早期阶段的足突剥离的巧合使作者怀疑星形胶质细胞可能在抑制DTC在大脑中的生长中发挥作用。
图2. 微转移激活后，星形胶质细胞足突从DTC相关血管中剥离
3. 星形胶质细胞通过层粘连蛋白-α2抑制乳腺肿瘤细胞为了以星形胶质细胞为唯一变量进行功能增益和功能丧失实验，并最终确定它们可能抑制乳腺肿瘤细胞生长的潜在方法，该研究创建了一种基于培养的大脑血管周围生态位的模拟物，由原代人类脑外膜成纤维细胞（HBAFs）和人类内皮细胞组成，经过工程改造，其可在无血清和无细胞因子的条件下存活。将内皮细胞添加到脑成纤维细胞促进了内皮细胞自组装成微血管网络（图 3a，b）。向这些生态位添加T4-2或MDA-MB-231细胞导致T4-2模型中的生长适度且具有统计学意义的细胞减少25.7%（图 3b，c），但对MDA-MB-231增殖没有影响。而且，与之前记录的骨髓和肺不同，内皮的添加并没有使任一细胞系进入静止状态，因为在仅含有HBAF或HBAF和内皮细胞的培养物中，任一BCC系的Ki67阴性部分之间没有显着差异（图 3d）。
与HBAF或HBAF和内皮细胞培养物相比，向含有HBAF和内皮细胞的培养物中添加星形胶质细胞显着抑制了T4-2和MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞的生长（图 3b、c）。这与单独的HBAF相比，两种培养物中Ki67-（静止）细胞的比例几乎翻了一番（图 3d）。内皮细胞或星形胶质细胞的浓度保持恒定而另一个浓度增加的实验证实，负责抑制的是星形胶质细胞。有趣的是，HBAF、内皮和星形胶质细胞的完整组合对于抑制是必要的。与仅由HBAF组成的培养物相比，细胞类型本身或任何成对组合都不会抑制生长。这表明，在培养中，乳腺肿瘤细胞的抑制表现为星形胶质细胞与内皮细胞的结合。
是什么推动了这种压制？观察到休眠的DTC在体内物理接触AQP4 星形胶质细胞足突（例如，图 2b，f）表明肿瘤抑制因子不能自由扩散。条件培养基实验证实了这一说法。因此，为了识别星形胶质细胞沉积到大脑血管周围生态位中的不溶性因子，通过ECM定量分析比较了脑血管生态位培养物和该作者实验室开发的其他基于培养的血管周围生态位模拟物（肺、骨髓和肝脏）之间表达的ECM分子的差异。这揭示了许多脑血管周围生态位特有的ECM分子（图 3e）。其中，我们确定了24个ECM因子在存在星形胶质细胞时富集了1.5倍（与单独的HBAF和内皮相比；图 3f）。为了确定这些星形胶质细胞衍生因子是否抑制了脑成纤维细胞上乳腺肿瘤细胞的生长，我们通过在HBAF中表达这18个ECM分子进行了功能筛选（无法成功克隆其他六个）。尽管没有内皮细胞和星形胶质细胞，但在18种过表达的ECM蛋白中，多功能蛋白聚糖、胶原XVIII、集聚蛋白和层粘连蛋白-α2显着减少T4-2细胞的生长至小于对照47%（图 3g，h ）。
公开可用的转录组数据显示，在这四种ECM蛋白中，只有层粘连蛋白-α2 主要由鼠脑中的星形胶质细胞表达。层粘连蛋白是由α-、β-和γ-链组成的三聚体蛋白家族；层粘连蛋白-α2是层粘连蛋白-211、-213 和-221蛋白质的组成部分。而内皮细胞以及在较小程度上周细胞为血管基底膜提供两种独特的层粘连蛋白（层粘连蛋白-411和-511），层粘连蛋白-211（包括lama2、lamb1和lamc1基因的产物）和-111是由星形胶质细胞产生并沉积在大脑实质基底膜中的主要层粘连蛋白。因此，为了评估抑制是否仅限于层粘连蛋白-211或在这些层粘连蛋白中更广泛地共存，向脑成纤维细胞中添加越来越多的纯化层粘连蛋白-211、-111、-411和-511，并测量BCC随时间的生长。只有层粘连蛋白-211在5 µg ml-1时显着降低了T4-2细胞的生长（至对照的44%）（图 3i）。两种星形胶质细胞层粘连蛋白在10 µg ml-1时都减少了生长，而层粘连蛋白-411和-511在任何测试浓度下都不会影响BCC生长（图 3i）。这些数据确定了星形细胞层粘连蛋白，尤其是层粘连蛋白-211，是大脑中DTC休眠的潜在驱动因素。
图 3. 基于培养的大脑血管周围生态位模拟物表明星形细胞层粘连蛋白-α2抑制DTC生长
4. 脑转移期间血管周围层粘连蛋白-211减少
量化了层粘连蛋白-α2对DTC相关血管和转移灶内血管的覆盖，使用从五个没有记录癌症史的受试者的脑微血管系统中获得的值作为对照。在快速尸检标本中发现了四个Ki67- DTC或微转移，所有这些都与层粘连蛋白-α2 微血管物理相关（图 4a，c）。另一方面，层粘连蛋白-α2在很大程度上从脑转移瘤中包含的CD31 结构中耗尽（图 4b，c）。与在正常脑内采样的CD31 血管、Ki67-DTC/微转移相关的血管、转移灶相邻的“正常”脑中的血管相比，对病灶中层粘连蛋白-α2的定量显示覆盖率降低了74.8-82.3%（图 4a-c）。
这一发现与在接种T4-2和MDA-MB-231细胞的NOD-SCID 小鼠的转移进展过程中观察到的一致，其中血管周围层粘连蛋白-α2的丧失与DTC增殖一致（图 4d、e)。事实上，对转移灶内和转移边界外的脉管系统的检查显示，层粘连蛋白-α2从转移性病变内的血管中剥离，但立即出现在其边界之外。其他星形细胞层粘连蛋白、层粘连蛋白-111未观察到这种模式，其保留在转移灶内的水平与邻近转移灶区域相当。
总而言之，这些数据表明星形细胞层粘连蛋白-211可以驱动和维持DTC处于静止状态。还需要一种体内功能丧失方法来更直接地检验这一假设。
图 4. 星形胶质细胞层粘连蛋白的损失与人类和小鼠的DTC增殖同时发生
5. 星形胶质细胞层粘连蛋白-γ1的敲除促进脑转移
为了测试星形细胞层粘连蛋白-211是否在体内驱动DTC静止，实验模型是通过将Nestin-Cre、Lamc1flox/ 杂合小鼠与纯合Lamc1flox/flox小鼠杂交来实现的（以下称为N-γ1-KO；图 4f）。巢蛋白由神经祖细胞表达，在胚胎晚期分化为神经元和星形胶质细胞。因为层粘连蛋白-γ1链缺失阻止了含γ1的层粘连蛋白的自聚合，所以理论上层粘连蛋白-211和-111在这些小鼠的神经元和星形胶质细胞中都存在缺陷。评估了该模型中血管周围层粘连蛋白-211的损失，并记录了层粘连蛋白-γ1的消耗，以及层粘连蛋白-α2的斑点状、马赛克缺失，但并未表现为统计学上显着的减少（图4g，h）。
荧光蛋白的表达是准确检测和测量转移量所必需的，它会触发免疫能力强的小鼠的免疫反应，例如用于这些实验的转基因。因此，需要一个额外的交叉以确保该模型中的实验不会受到移植肿瘤细胞中荧光蛋白（即tdTomato）表达引入的任何潜在伪影的阻碍。因此将N-γ1-KO与Cx3cr1-GFP；CCR2-RFP小鼠杂交以产生tdTomato耐受的N-γ1-KO小鼠，并使用白细胞标记CD45的存在/不存在来区分tdTomato 肿瘤细胞和红色荧光蛋白(RFP) 单核细胞。然后通过心内注射将同源、tdTomato 、三阴性乳腺癌细胞（E0771）递送至耐受的N-γ1-KO小鼠或其对照同窝小鼠（图 4i）。
这些实验在13天后终止，因为一部分小鼠表现出严重的神经系统症状。在这个时间点的全脑成像显示，所有接种tdTomato-E0771的N-γ1-KO小鼠都比它们的同窝对照发生了更多和更大的转移（图 4j）。检查跨越整个大脑的脑切片显示N-γ1-KO中的转移性病变数量增加了4.6倍，伴随着每个病变的平均大小增加了3.5倍（图 4k，l）。N-γ1-KO小鼠大脑中微血管的AQP4覆盖率降低，证实N-γ1-KO中的转移增加不仅仅是由于接种E0771细胞后外渗增加。在心内接种后仅3天对DTC浓度的定量显示，在这个早期时间点占据大脑的肿瘤细胞数量在N-γ1-KO及其同窝对照中是相似的。巢蛋白驱动的层粘连蛋白-γ1损失对转移性生长的影响是大脑特有的。
总之，在来自基于培养的大脑血管周围生态位的模拟物数据的完整背景下，N-γ1-KO小鼠脑转移的显着促进表明星形细胞层粘连蛋白-211是大脑中DTC静止的主要执行者。
6. DTC肌营养不良蛋白聚糖（DAG）介导层粘连蛋白-211的信号抑制
层粘连蛋白-211与三种受体结合：整合素-α6β1、整合素-α7β1和由DAG1编码的非整合素受体肌营养不良蛋白。之前的工作表明整合素-β1的聚集会驱动乳腺上皮细胞的解体和恶性生长，同时也促进包括脑在内的转移部位的生长，但肌营养不良蛋白聚糖在DTC生物学中的作用仍未确定。因此，采用功能丧失方法探索DTC肌营养不良蛋白或整合素对于解释星形细胞层粘连蛋白-211的信号抑制是否重要（图 5a）。
因为整合素-α7在本研究中使用的细胞系在转录水平上的表达可以忽略不计，作者使用shRNA敲除亲代T4-2 细胞中的DAG1、ITGA6或ITGB1，它们作为休眠的DTC和微转移在脑内持续存在，但很少产生脑转移（图1b）。通过免疫印迹评估肌营养不良蛋白聚糖α和β结构域的敲低，并选择了两个克隆（克隆2和4）实现了大于52%的肌营养不良蛋白聚糖β结构域敲低（图 5b-d）。为了便于比较，作者鉴定了两个克隆，它们导致整合素-α6亚基敲低48%（克隆3）和76%（克隆5），另一个克隆实现了83%整合素-β1的敲低（图 5b-d）。
用shDAG1（克隆2或4）、shITGA6（克隆3或5）、shITGB1或它们各自的对照转染的T4-2细胞通过心内注射递送至NOD-SCID小鼠。在接下来的6周内，近四分之三接种了shEmpty T4-2细胞的小鼠要么未出现可检测的病变，要么出现单个微转移病变（图 5g-i）。相比之下，接种shDAG1-T4-2细胞的23/26只小鼠(>88%)的脑损伤在相同的时间过程中通过全脑成像可在体外检测到。脑切片检查显示DAG1敲低后转移病灶数量增加了5.1-6.9倍（图 5g，h）。这些病变的平均大小也远大于由shEmpty T4-2引起的病变，并随着肌营养不良蛋白聚糖β结构域敲低的水平而定（图 5i）。
相比之下，ITGA6敲低对T4-2脑转移的影响不如DAG1敲低后观察到的那么强烈。虽然一个克隆（克隆3）使转移病灶的总数增加了三倍，但另一个（克隆5）在这方面没有影响（图 5j，k）。两者都没有以统计学上显着的方式影响平均病变大小（图5l）。这些数据可以被解释为意味着整合素-α6 限制了脑转移的T4-2细胞的初始生长。最后，接种shITGB1-T4-2的小鼠没有发生任何可见的脑转移，导致这些小鼠完全没有病变（图 5m-o）。这一结果与之前的发现一致，即整合素-β1促进脑内转移性生长。
图 5. DTC肌营养不良蛋白多糖是星形胶质细胞层粘连蛋白介导的静止的主要传感器
7. YAP信号在休眠DTC中受到抑制
Yes相关蛋白1（YAP）的核积累可以通过与TEAD转录因子的结合激活一组增殖相关基因。Hippo通路是一种进化上保守的丝氨酸激酶级联反应，具有控制细胞生长和有机体大小的相关调节蛋白和支架蛋白。而它的主要生长调节功能是通过阻止Yes相关蛋白1（YAP）的核积累来执行的。
该研究设计了一个单细胞测序实验，以了解肌营养不良蛋白聚糖影响DTC静止的潜在机制（图 6a）。解剖、消化和流动纯化通过用tdTomato 、T4-2细胞的脑转移变体接种NOD-SCID小鼠产生的脑转移瘤中的肿瘤细胞（图 6b）。同时，消化剩余的未受累脑组织，并通过流动从该消化物中纯化残留的tdTomato 肿瘤细胞（图 6b）。总共有3,973个来自脑转移瘤的细胞和1,252个来自未受累的脑DTC通过单细胞RNA测序进行了转录分析。
基于一致流形逼近和投影（UMAP）的降维算法和基于图的Leiden聚类算法从这些数据中确定了十个不同的群体（图 6c）。尽管大多数人群同时存在转移灶和微转移灶，并且在前者中有所扩大，但有三个值得注意的例外：簇0，这是转移灶独有的；簇2，在转移灶内急剧扩大；和簇5，这是从完全未受累的大脑中分离出来的微转移灶所独有的（图6d）。我们选择了每个簇特有的差异表达基因，并使用 STRINGdb数据库进行基因集富集分析，以通过最高置信度的相互作用模式连接每个簇内的基因产物（图 6e，f）。对这些簇中富集的基因的分析表明，簇0可能反映脑转移的生物能量需求，而簇2富含细胞周期相关基因，可能是主要包含在转移灶内的增殖群体（图6e，f）。另一方面，簇5富含包含Hippo通路信号的基因网络（图 6e，f）。
对来自单细胞数据的22个YAP靶标针对YAP靶基因评分的评估证实了簇0中这些基因的富集，与簇5相比，MKI67（编码Ki67的基因）也显著富集（图 6g）。事实上，在所有细胞/簇的细胞周期函数中分析YAP靶基因评分显示与S期和G2/M期呈正相关，与静止期有很强的反相关性（图 6h）。虽然这些数据证实了YAP与脑转移之间存在令人信服的、先前记录的关联，但我们试图确定休眠DTC中YAP的核排除是否与层粘连蛋白-211-DAG信号传导有关。
图 6. 单细胞测序数据表明YAP信号在DTC中受到抑制
8. 肌营养不良蛋白聚糖可能通过将YAP束缚在细胞膜上来影响DTC静止
我们通过邻近连接测定（PLA）探测了YAP和肌营养不良聚糖之间的物理相互作用，这是一种通过邻近依赖性杂交和寡核苷酸结合抗体扩增检测蛋白质-蛋白质相互作用的灵敏方法（图 7a）。正如预期的那样，单独用肌营养不良聚糖或YAP抗体探测的单个转移T4-2细胞没有产生PLA信号。当应用两种抗体时，在正常大脑中检测到信号，表明骨骼肌和心肌细胞中发现的机制也可能适用于此处。对扩散性乳腺肿瘤细胞的检查显示，强PLA信号局限于单个DTC与相邻细胞的界面；在微转移和大转移病变中很少检测到信号，这与肌营养不良聚糖结合并将YAP隔离到静止DTCs的膜且这种束缚在增殖后丧失的假设一致。
我们继续测试YAP激活是否足以驱动静止DTC的生长。YAP活性受核转位的调节：一旦在S127被Hippo效应子磷酸化，它就会被限制在细胞质中，在那里它可以在S397进一步磷酸化并靶向降解。因此，我们在T4-2细胞中过表达了两种形式的组成型活性YAP：S127A突变体，其中丝氨酸127突变为丙氨酸，因此YAP能自由穿梭到细胞核；以及S127A/S397A突变体，其中丝氨酸397也突变为丙氨酸并且YAP被有效地保护免受磷酸化的影响。同时表达了无法与其转录共激活因子TEAD相互作用的功能丧失YAP突变体(S94A)。通过免疫印迹证实每个突变体的表达。S127A突变体导致脑转移瘤的数量和大小大幅增加。S127A/S397A双突变体促进脑转移相当于S127A单突变体，但不超过。不能通过TEAD激活转录的YAP对任一参数都没有影响。这些数据与完整的功能一致，层粘连蛋白结合的肌营养不良聚糖从细胞核中隔离YAP并驱动DTC静止。
一旦在NOD-SCID小鼠中接种，YAP敲低会抑制与YAP消耗水平相称的T4-2细胞的生长。总之，这些数据揭示了一种机制，即休眠是依靠YAP的细胞质隔离来影响通过DTC肌营养不良蛋白聚糖介导的星形胶质细胞层粘连蛋白-211信号驱动的静止。该轴在任何水平上的破坏——从星形胶质细胞足突剥离和伴随的层粘连蛋白211损失，到YAP的核穿梭——足以打破DTC静止并以大脑特有的方式催化转移的出现。
图 7. 肌营养不良蛋白聚糖与YAP物理结合，通过阻止YAP穿梭到细胞核使DTC静止
总结
脑内DTC静止的特异性机制：星形细胞层粘连蛋白-211与DTC上的DAG受体结合，将YAP从细胞核中隔离以驱动静止；破坏层粘连蛋白-211-DAG结合会使YAP核穿梭、TEAD依赖性转录和脑转移定植。
原文来源：Dai JX et al. Astrocytic laminin-211 drives disseminated breast tumor cell dormancy in brain. Nature Cancer 2021.
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