编译：微科盟-赵倩，编辑：微科盟悄咪咪、江舜尧。
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导读细胞已经进化出一个复杂的生化通路网络，统称为DNA损伤反应(DDR)，以防止有害的突变遗传给他们的后代。DDR通过细胞周期检查点激活和其他全局细胞反应来协调DNA修复。编码DDR因子的基因经常在癌症中发生突变，导致基因组不稳定，这是许多肿瘤的一个内在特征，是其生长、转移和对造成DNA损伤的治疗(如放疗)作出反应的基础。更深入了解遗传DDR消除对治疗反应影响的实例，是在BRCA1或BRCA2突变的肿瘤中。由于同源重组DNA修复受损，这些肿瘤依赖于替代修复机制，并且对聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的化学抑制剂敏感，这种酶特异性杀死同源重组缺陷癌细胞，并已成为靶向癌症治疗的范例。现在很清楚，DDR基因之间存在许多其他合成致死关系。至关重要的是，在临床上其中一些相互作用可以用于对PARP抑制剂产生耐药的肿瘤的靶向治疗。本文研究讨论了应用小分子抑制剂使DDR失活的最新策略，并重点介绍目前正在进行临床评估的一些化合物。
原名：Targeting DNA damage response pathways in cancer译名：癌症中的DNA损伤反应通路
期刊：Nature Reviews Cancer
IF：69.8
发表时间：2022年12月
通讯作者：Andrew N. Blackford和Madalena Tarsounas
通讯作者单位：牛津大学
DOI号：10.1038/s41568-022-00535-5
DNA是一种相对稳定的有机分子，但其基因组不断受到来自各种内源和外源性的攻击。因此，细胞进化出一套复杂的共同应对这种威胁的生化通路系统，称为“DNA损伤反应”(DDR)。在癌细胞和具有遗传性癌症倾向的个体 胚系中，发现了编码DDR相关酶的基因突变，强调了DDR在人类生理中的重要性。的确，DDR缺陷引起的基因组不稳定性是癌症的一个标志，因为更大的突变负担增加了致癌基因激活和抑癌基因失活的机会，导致肿瘤发生。肿瘤内癌细胞的基因多样性也增加了放疗或化疗后出现耐药克隆的机会，从而促进癌变复发。然而，快速增殖的肿瘤固有基因组不稳定性，也为研究提供了靶向DDR通路治疗的机会，从而通过额外的复制应激、外源性DNA损伤和/或DDR抑制，特异性杀死癌细胞。在很大程度上，这可能解释了放疗和各种破坏DNA的化疗药物(例如作为烷化剂和拓扑异构酶抑制剂)，在早期治疗的成功。然而，这样的药物往往会不分青红皂白地破坏健康组织，导致严重的副作用。在某些癌症中，因为已经确定了特定的遗传脆弱性，目前处于一个独特的位置，可以利用临床中合成致死的概念，即失去一个细胞通路导致对另一个通路的高度依赖，这在正常情况下是不必要的(表1，2)。这也许是最好的例子，通过使用聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂来特异性靶向缺乏同源重组(HR) DNA修复因子BRCA1或BRCA2(BRCA1/2)或HR受损的肿瘤(框1，2)。随后，很明显，一些具有野生型BRCA1/BRCA2基因的肿瘤也可以通过独立于HR失活的机制对PARP抑制剂敏感。针对癌症中的DDR，不限于PARP抑制剂(表2)，因为近年来确定了其他潜在的DDR靶点；一些靶点的小分子抑制剂已经研发，其中一些正在进行临床试验(表1)。在这篇综述描述了主要的DNA损伤检查点和修复通路，并讨论了目前正在临床评估使用的小分子抑制剂的DDR失活策略。此外，研究强调了DDR抑制剂耐药的机制，以及如何通过理解和靶向耐药肿瘤的分子通路来克服耐药。表1|关于DDR抑制剂的部分临床试验。
表2|关于PARP抑制剂的部分临床试验。
1 DDR
1.1 DNA损伤激活由检查点激酶介导的信号级联
DDR从损伤识别和DNA修复通路的参与开始。根据遗传毒性应激的类型和复杂性，可能会启动细胞信号级联，改变周围的染色质环境，激活细胞周期检查点，并通过改变转录或翻译修改基因表达。如果损伤不能快速修复，持久的DDR信号也可以通过促进分化、衰老或程序性细胞死亡来改变细胞命运。从而，DDR保持了基因组稳定性，以最大限度地提高了将遗传物质完整无缺地传给下一代的机会。ATM和ATR是负责协调细胞对DNA双链断裂(DSBs)和复制应激反应的激酶 (图1)，包括DNA修复、检查点激活、细胞凋亡、衰老以及染色质结构的改变、转录和pre-mRNA剪接。为了实现这一目标，他们将数百种底物磷酸化，以应对DNA损伤。下游细胞周期检查点激酶CHK1和CHK2分别是ATR和ATM的主要底物，并负责下调细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的活性，以响应基因毒性应激而停止细胞周期进程。在细胞G1期中，ATM和CHK2通过p53的磷酸化和稳定化实现，导致CDKN1A的转录，从而编码CDK抑制剂p21(图1)。在DSBs，ATM被招募，并促进组蛋白H2AX磷酸化，进而招募DNA损伤检查点蛋白1(MDC1)的介质。在间期细胞，ATM募集和磷酸化MDC1，进一步催化导致DNA损伤介质蛋白53BP1和BRCA1募集的磷酸化和泛素化事件；然而，53BP1和BRCA1在有丝分裂期间均未被募集。相反，酪蛋白激酶2(CK2)依赖的MDC1磷酸化介导MDC1和DNA拓扑异构酶2结合蛋白1(TOPBP1) 相互作用，它与PP2A的细胞抑制剂(CIP2A)一起被招募到DSBs图1)。TOPBP1和CIP2A一起形成丝状结构，可以桥接两个MDC1病灶，从而束缚两个DSBs末端在一起。这确保了正确的染色体分离，直到DSBs在接下来的G1期被修复。
在细胞周期的S期和G2期，ATR及其下游靶点CHK1主要负责通过CDC25磷酸酶家族的磷酸化和失活来激活检查点。这些会去除CDK1和CDK2的抑制性磷酸化，由激酶WEE1和WEE1样激酶PKMYT1沉积 (图1)。此外，ATR控制S-G2检查点，可以防止在复制完成之前进入有丝分裂。与ATM不同，ATM通过MRE11–RAD50–NBS1(MRN)与 DSBs的结合而激活，ATR由ATR相互作用蛋白(ATRIP)招募，ATRIP与复制蛋白A(RPA)包裹的单链DNA(ssDNA)结合，在停滞的复制叉处生成。然后，ATR被复制应激反应蛋白ETAA1或TOPBP1激活，它们分别在ssDNA上与RPA结合或在ssDNA–双链DNA连接处与RAD9-RAD1-HUS1(9-1-1)复合物结合。因此， ATR在S期被激活，以应对广泛的遗传毒性损伤，包括停滞的复制叉、前导链或滞后链ssDNA间隙或切除的DSBs。图1 |细胞周期依赖性DDR在DSBs的激活。MRE11-RAD50-NBS1 (MRN)复合物可感知DNA双链断裂(DSBs)，并在断裂位点招募并激活ATM，以协调DNA损伤反应(DDR)信号。左图：G1期间，ATM促进RNF168的激活，其泛素化组蛋白H2A。这种修饰加上组蛋白H4 Lys20二甲基化标记导致53BP1的募集和ATM介导的53BP1磷酸化，这促进了它与RIF1、REV7和shieldin复合体(SHLD)其他成员的相互作用。ATM激酶活化也控制p53的稳定性，从而在DNA损伤时触发G1骤停。在S期，BRCA1-BARD1复合物被招募到DSBs上，并通过识别未甲基化的H4 Lys20和H2A Lys15泛素化来抵消53BP1，以促进DNA端切除和RAD51加载到切除的DNA端。复制蛋白A (RPA)包裹的单链DNA也通过与ATR相互作用蛋白(ATRIP)相互作用招募ATR。在双链DNA-单链DNA连接上，ETAA1结合到RPA包裹的单链DNA或拓扑异构酶2结合蛋白1 (TOPBP1)结合RAD9-RAD1-HUS1(9-1-1)复合体激活ATR，ATR磷酸化CHK1促进CDC25A降解，从而阻止细胞周期依赖性激酶1 (CDK1)和CDK2的激活。激酶WEE1 (CHK1的磷酸化靶点)和PKMYT1介导CDK1和CDK2的抑制性磷酸化，阻止细胞进入有丝分裂。右图：在有丝分裂中，ATM依赖的H2AX磷酸化激活DNA损伤检查点蛋白1 (MDC1)的介质，MDC1通过其酪蛋白激酶2 (CK2)介导的磷酸化结合TOPBP1和PP2A的细胞抑制剂(CIP2A)。TOPBP1和CIP2A形成丝状结构，将DSBs两端系在一起。1.2 多种DNA修复通路处理不同的DNA损伤
最常见的DNA损伤类型是，只有一条DNA双螺旋链受到影响，要么通过磷酸盐骨架中的单链断裂(SSB)或通过DNA碱基的化学修饰。大多数这样的损伤是可以通过碱基切除修复或核苷酸切除修复通路识别和修复，或在复制过程中通过翻译合成完全绕过。DNA复制期间，错误的核苷酸可以被合并，从而导致两个不匹配的碱基；这些由错配修复 (MMR)通路处理。或者，核糖核苷酸可以代替脱氧核糖核苷酸进入基因组；这些被核糖核酸酶H2(RNase H2)切除。偶尔，双螺旋的两条链可以交联；取决于他们的化学性质，这种DNA链间交联可以通过Fanconi贫血通路、DNA糖基化酶NEIL3或其他不完全表征链间交联修复通路进行修复。蛋白质还可以共价捕获在DNA上，需要由特殊蛋白酶如SPRTN介导的DNA-蛋白质交联修复。SSBs，或单链切口，主要被酶PARP1或PARP2识别，催化聚(ADP-核糖)(PAR)链自身和相邻的靶蛋白形成。PARP1及其在SSB上聚(ADP-核糖基)化 (PAR ylation)活化招募支架蛋白XRCC1，它引导DNA连接酶3(LIG3)和辅助修复因子重新连接断裂。PARylation是高度动态的，并且通常是瞬态过程，因为PAR链可以通过聚(ADP-核糖)糖水解酶(PARG)快速降解。PARG活化使PARPs和PARylated蛋白恢复到去(ADP-核糖基化)状态，以促进后续几轮SSB的修复，而不仅仅是SSB修复的负调节因子。因此，PARG抑制，类似于PARP抑制，能够降低SSB修复率。
虽然SSB是最常见的DNA损伤，但它们相对很容易修复。相比之下，DNA DSBs对基因组完整性构成更大的威胁，修复起来要困难得多。人类细胞中，有两种主要的DSB修复通路(图2)。第一个是非同源末端连接(NHEJ)通路，它修复了绝大多数的双末端DSBs。相比之下，如果在S期形成单一末端DSBs时，DNA复制叉崩溃，NHEJ是有毒的，因为它可以通过重新连接不同的染色体DNA末端来产生染色体重排。因此，在复制叉，NHEJ被第二个主要DSB修复通路HR的组分积极抑制。HR在特定情况下也受到欢迎，例如Fanconi贫血通路的链间交联修复或在减数分裂期间诱导的程序化DSBs修复，此时NHEJ会具有类似的破坏性。图2 | DSB修复的主要和备份途径。DNA双链断裂(DSB)修复通路的选择取决于细胞周期阶段和DNA末端切除的程度。大多数DSBs通过非同源端连接(NHEJ)修复，由Ku70-Ku80异源二聚体与DNA端结合启动。伴随DNA依赖的蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)的募集和自磷酸化，将DNA末端聚集在一起，并允许它们与XRCC4-DNA连接酶4 (LIG4)以及XLF或PAXX一起连接。在S期，作为MRE11-RAD50-NBS1(MRN)复合体一部分的MRE11和CtIP共同启动切除以促进同源定向修复。远程切除需要BLM-DNA2解旋酶核酸酶或EXO1核酸酶活化，并导致复制蛋白A (RPA)包裹的单链DNA悬垂物的形成。同源重组(HR)需要BRCA1、PALB2和BRCA2协同作用，将RAD51加载到单链DNA上，取代RPA。RAD51核蛋白丝其作为DNA合成的模板，促进入侵姐妹染色单体。或者，广泛切除产生单链退火(SSA)的底物，其中RAD52促进每个单链DNA端同源序列的退火。通过ERCC1和XPF对3'端单链的后续处理，允许LIG1介导DNA连接。RAD52也参与断裂诱导的复制，这与SSA不同，可能有助于HR缺陷细胞的基因组改变。相比之下，短距离切除足以激活替代末端连接(alt-EJ)，其中DNA聚合酶-θ (POLQ)促进短同源序列的退火，随后是DNA合成和依赖LIG1或LIG3的DNA末端重新连接。
NHEJ通常被认为是容易出错的(例如，在通过CRISPR–Cas9进行基因编辑的环境中)，因为它不使用同源基因模板进行修复。实际上，大部分时间NHEJ都是非常高效且准确的，这解释了为什么细胞进化会优先使用NHEJ。Ku，一个由Ku70和Ku80亚基组成的篮状异二聚体蛋白复合物，识别并结合断裂的DNA末端时，该通路启动(图2)。Ku主要作为下游NHEJ组件的募集平台，同时分别保护DNA末端免于细胞解旋酶和核酸酶的解旋和降解。Ku结合的DNA末端快速招募DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)催化亚基(DNA-PKcs)，形成DNA-PK全酶，这对于NHEJ是必不可少的，部分是通过促进DNA末端束缚，从而促进DNA连接。有趣的是， NHEJ中DNA-PK激酶活化最著名的底物是DNA-PKcs本身。这种自磷酸化对于修复过程仍然是必不可少的，因为它促进DNA末端突触和DNA-PK从DNA末端解离。随后，由LIG4及其稳定合作伙伴XRCC4进行DNA末端连接，这一步也需要XLF或PAXX，两个部分冗余的NHEJ核心因子。NHEJ辅助因子，包括特异性核酸酶(例如，Artemis)和聚合酶(例如，DNA聚合酶-μ和DNA聚合酶-λ)，也在特定情况下促进准确的DSB修复，但不是对所有NHEJ修复都是必须的。与NHEJ不同，HR通路使用同源DNA分子(通常是姐妹染色单体)作为修复模板。当核酸酶消化DSB位点的双链DNA末端，以产生ssDNA悬垂时，HR启动(图2)，这一过程称为“DNA末端切除'。这导致Ku从DNA末端去除并产生ssDNA束，这些束迅速被RPA包裹。在细胞周期中，DNA末端切除受到严格控制，因此它发生仅在S和G2期间，这是由于CDK依赖性CtIP的磷酸化(也称为RBBP8)造成的，一种已知可刺激末端切除的因子。这也防止二倍体细胞使用同源染色体，而不是姐妹染色单体作为修复的模板(否则可能导致杂合性丢失)。例外可能会发生在基因组的重复区域，例如核糖体或着丝粒DNA，在G1期细胞中也可以发生切除和HR。在CtIP和MRN复合物产生初始ssDNA悬垂后，两种截然不同但可能冗余的通路促进了末端切除发生。第一条通路依赖于核酸酶EXO1，而第二个需要核酸酶DNA2和解旋酶BLM。切除后，RPA在ssDNA上被重组酶RAD51取代，这一步骤需要BRCA1和BRCA2。这是因为BRCA1通过与PALB2的相互作用，促进BRCA2募集到DSB位点，后者将RAD51直接加载到ssDNA末端。RAD51在ssDNA上形成核蛋白丝，促进链侵入和位移环(D环)的形成。这种DNA结构允许使用姐妹染色单体作为模板跨断裂位点合成DNA，以防止遗传信息的改变。最后，入侵链可以通过合成依赖性链退火进行位移和HR完成。或者，如果发生第二末端捕获，形成双霍利迪结，该连接要么是被Bloom综合征复合体(包含BLM和拓扑异构酶TOP3A)，要么由结构-特异性核酸酶SLX4–MUS81或GEN1溶解。DNA末端切除的程度决定了替代DNA修复通路的用途(图2)，最显著的是单链退火和交替末端连接(也称为DNA聚合酶-θ(POLQ)-介导的末端连接或微同源介导的末端连接)，它们分别依赖于RAD52和POLQ。单链退火和选择性末端连接在S阶段和有丝分裂中起作用，分别作为HR失活时的备用修复通路。1.3 DNA损伤位点的染色质修饰控制DNA修复通路的选择
虽然细胞周期依赖性磷酸化事件(例如，CDKs对CtIP的磷酸化)能够在细胞周期的S期和G2期启动DNA切除和HR，但NHEJ仍然是整个间期的主要的DSB修复通路。这部分是由于BARD1（BRCA1的稳定结合伙伴）和53BP1在染色质水平上对DSB修复的调节，其分别竞争促进末端切除和拮抗末端切除。BARD1和53BP1作为组蛋白H2A Lys15(H2AK15)泛素化，一种由RNF168沉积的DNA损伤诱导的组蛋白修饰(图1)，和组蛋白H4 Lys20(H4K20)甲基化状态的阅读器。组蛋白H4 Lys20二甲基化是沉积在成熟染色质上的组蛋白修饰，因此在S期中不存在新生的子代DNA链。通过直接结合含有H2AK15ub和H4K20me2的核小体，53BP1募集下游效应蛋白，包括RIF1和shieldin复合物，通过调节3D染色质结构，保护DSB末端和/或募集DNA聚合酶-α以填补切除期间产生的ssDNA间隙，以抵消DNA末端切除、。因此，通过抑制ssDNA的产生，53BP1和它的结合伙伴确保有足够的长度RAD51丝无法组装，从而抑制HR。53BP1介导的NHEJ在S期具有高度毒性，此时复制叉的崩溃导致单一末端DSBs产生。当连接来自不同染色体的两个这样的末端时，染色体易位发生。因此，在复制过程中发生的DSBs必须由HR修复，而不是NHEJ。这是通过BRCA1–BARD1复合体实现的，与53BP1一样，识别RNF168-介导的组蛋白H2A Lys15泛素化标记(图1)，但结合未甲基化组蛋白H4 Lys20，而不是二甲基化的组蛋白H4 Lys20。重要的是，复制叉附近的新生染色质富集未甲基化的组蛋白H4 Lys20，与成熟的染色质形成对比，成熟的染色质复制后在H4K20上逐渐甲基化。这样，细胞确保53BP1在成熟染色质中发生DSBs的整个间期促进NHEJ，而BRCA1被招募到DNA复制过程中发生的DSB附近的染色质，并被HR修复。然而，要注意的是，在S期，53BP1仍然被招募到DSBs更远端的染色质位点。这有助于通过防止大范围的远距离切除来保持HR的准确性，而远距离切除可能激活单链退火(图2)，这是一种RAD52介导的会产生大量基因组缺失的修复过程。如果DNA末端未广泛切除，则可选择替代末端连接(图2)用于修复DSBs。然而，可选的末端连接和单链退火通路都是高度突变的，仅当更准确的修复通路(NHEJ或HR)出现损害时才进行备份。该模型得到了最近的证据支持，证据表明在细胞分裂发生之前直到有丝分裂开始，依赖POLQ的DSB修复受到限制。这种最后的诱变DSB修复比未修复的DSB进行有丝分裂更可取，在有丝分裂中，染色体分离可能导致微核和灾难性的断裂-融合-桥循环和染色体碎裂等事件，这是癌症中染色体不稳定的两个来源。2 PARP抑制剂在癌症靶向治疗中的应用
BRCA1或BRCA2中的胚系杂合突变，使受影响的个体易患多种类型的癌症，包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌。如前所述，BRCA1和BRCA2通过HR通路促进准确的DNA修复，这对于在暴露后保持基因组完整性至关重要，如电离辐射或DNA间链交联剂等DNA损伤治疗。在没有外来挑战的情况下，BRCA1和BRCA2在DNA复制中对维持基因组稳定性至关重要。虽然复制本身不是必需的，但BRCA1和BRCA2通过防止核酸酶对新生DNA的降解和促进受损复制叉的HR修复来促进复制。当BRCA1或BRCA2被废除时，由复制失败引起的DNA损伤会积累。他们通过容易出错的备份路径进行修复，从而产生基因组改变(插入、缺失和染色体重排)，对基因组完整性构成威胁，并且在长期来看，促进肿瘤发生。如前所述，PARP在SSB修复中起着关键作用。因此，最初假设PARP抑制特异性杀死BRCA1/2缺陷细胞是由于SSB的积累，当它们被复制叉遇到时会转换为DSBs。与复制相关的DSBs是单一末端的，因此必须是由HR修复，因为NHEJ会产生有毒的基因组重排。BRCA1/2缺陷和更普遍的HR缺陷细胞对PARP的抑制敏感，被认为是由于PARP依赖的SSB修复的抑制，导致复制过程中的DNA损伤(SSBs和DSBs)的积累。然而，这个模型并不能完全解释BRCA1/2缺陷细胞对PARP抑制剂敏感的程度，与他们在DNA上“捕获”PARP的程度相关的观察结果。实际上，ALC1(也称为CHD1L)、RNaseH2或ATPase p97(也称为VCP)等因子的缺失或抑制，增加PARP捕获，BRCA1/2的丢失和对PARP抑制剂的敏感性增加会导致合成致死。此外，最近的研究表明，PARP抑制导致复制叉后面ssDNA间隙的积累，这起源于处理冈崎片段的缺陷。这些间隙转化为需要BRCA1/2进行修复的DSBs，需要通过有丝分裂和随后的S期进展。需进一步的工作，来明确关于PARP抑制剂诱导BRCA1/2缺陷细胞致死的精确机制。然而，在PARP抑制和BRCA1/2缺陷之间合成-致死关系的发现，为在具有HR缺陷的肿瘤中选择性靶向DDR因子建立了范例(框1)。尽管存在获得性耐药，这依然为未来的癌症研究和临床应用提供了一个令人兴奋的方向， (框3)，仍然是临床上使用PARP抑制剂的一个主要缺陷。确实，正如接下来的讨论那样，在已经确定的DDR因子和路径之间的新型合成-致死相互作用，其中一些已经在早期临床试验中进行了测试。3 靶向DDR激酶在临床上的应用
3.1 ATM抑制剂
ATM是协调DSB修复的顶端DDR激酶，因此已开发出多种化合物用于选择性抑制(表1)。鉴于ATM在DSB信号和修复中的关键作用，ATM抑制联合放疗是一种明显且有吸引力的，用于根除肿瘤治疗的组合，目前正在多项临床试验中探索。早前，有研究表明，特异性ATM抑制剂可用于增加DNA损伤剂的抗癌活性，如拓扑异构酶抑制剂或PARP抑制剂。此外，ATM缺乏会使癌细胞对拓扑异构酶1抑制剂或PARP抑制剂敏感。这具有临床意义，因为ATM经常在零星的癌症中发生突变或失活，包括肺癌、乳腺癌、脑癌或胰腺癌。在机制上，PARP和拓扑异构酶1抑制剂会导致单一末端DSBs，这需要HR进行准确的修复。ATM信号的丢失延迟末端切除，并将单一末端DSBs的修复引导至NHEJ，从而导致毒性染色体融合。相反， 对NHEJ至关重要的XRCC4、LIG4或XLF的缺失，促进了ATM缺陷细胞对PARP或拓扑异构酶1抑制剂的耐药性，因为单一末端DSBs可以被HR修复。然而，ATM抑制在BRCA1-53BP1缺陷或BRCA1-REV7缺陷小鼠细胞中逆转PARP抑制剂耐药性，这一效应由减少末端切除介导。因此，ATM抑制剂与PARP或拓扑异构酶1抑制剂的联合可能是一种有前途的治疗策略，目前正在临床研究中(表1)。此外，先前的研究表明，在范可尼贫血通路中ATM抑制伴随基因丢失而合成致死，最近在多个CRISPR–Cas9筛选中验证了这项观察结果。因此，在一种或多种缺陷的肿瘤中，超过20个范可尼贫血基因(例如，约5%的卵巢癌)带有缺陷，可能是使用ATM抑制剂治疗的有吸引力的候选者。尽管正在进行多项临床试验(表1)，但ATM抑制剂的临床疗效，还有待证明。还值得注意的是，胚系杂合ATM突变易导致血液系统恶性肿瘤和其他癌症类型。因此，应仔细考虑，以确保ATM的治疗益处超过了癌症患者的风险，因为随着暴露延长，ATM抑制剂可能导致多个组织中新发肿瘤的形成。3.2 DNA-PKcs抑制剂
DNA-PKcs，全酶DNA-PK的催化亚基，也包括蛋白质Ku70和Ku80，在整个细胞周期中，对于通过NHEJ进行的DSB修复至关重要。与此一致，缺乏DNA-PKcs的细胞对DSB诱导剂敏感，用DNA-PKcs抑制剂治疗可以重现这种效果。与ATM类似，DNA-PKcs抑制联合放疗是一种有吸引力的抗癌策略。重要的是，响应DSBs的底物磷酸化中，因为ATM和DNA-PKcs仅显示部分冗余，它们的伴随损失是合成致死的。因此，DNA-PKcs抑制剂，尤其是那些目前正在临床试验中的抑制剂(表1)，可能对ATM缺陷型肿瘤也有效。这个概念可能不适用于XRD-0394等抑制剂，它是ATM和DNA-PKcs的双重抑制剂，最近进入I期临床试验，但尚未公开其数据。3.3 ATR抑制剂
ATR激酶作用于S期，通过调节起始点火和分叉进程确保进行及时准确的DNA复制。因为癌细胞经常积累停滞的复制叉，它们依赖ATR信号来维持DNA复制。由于p53缺陷或癌基因激活，G1-S转化控制缺陷细胞同样依赖于ATR信号。因此，ATR是一个有吸引力的癌症治疗靶点，近年来开发多种具有特异性和强效性的ATR抑制剂(表1)。ATR抑制剂增加复制叉停滞，并促进染色体断裂，导致细胞毒性。由于癌基因的过度表达，引起癌细胞复制应激，例如编码细胞周期蛋白E1的癌基因对ATR抑制剂特别敏感。相似的结果在ALK和MYCN放大的神经母细胞瘤的异种移植小鼠模型中观察到，其中ATR抑制导致肿瘤生长抑制。含有干扰DNA修复的ATM突变的癌细胞，也对ATR抑制剂敏感。ATR抑制剂使肿瘤对电离辐射敏感，并且它们的组合可有效对抗三阴性乳腺癌患者来源的异种移植物(PDX)模型。有趣的是，最近的研究已证明ATR抑制剂可增强辐射诱导的干扰素信号，表明ATR抑制剂与免疫疗法的潜在治疗组合可能。这个概念在去势抵抗性前列腺癌的小鼠模型中是有效的，其中ATR抑制剂联合靶向免疫检查点分子PDL1的免疫疗法显示出协同抗肿瘤活性。ATR抑制剂和免疫检查点阻断剂的组合，目前正在临床试验中进行测试(表1)；例如，ATR抑制剂VE-822和抗PDL1免疫疗法avelumab的组合，被用于治疗带有DDR基因突变的实体肿瘤。多项研究揭示了ATR抑制剂和现有抗癌药物之间的协同作用，这些药物干扰DNA复制或造成DNA损伤(例如，顺铂、吉西他滨和替莫唑胺)。重要的是，有研究指出，ATR抑制剂与PARP抑制剂能够协同作用对抗BRCA1/BRCA2突变的肿瘤，从机制上讲，在BRCA2缺陷细胞中，ATR抑制剂会加剧PARP抑制剂引起的一些病理，包括加速有丝分裂进入、染色质桥积累和断裂和/或滞后的染色体，导致PARP抑制剂的细胞毒性增加。这两种药物之间的协同作用最近已扩展到野生型BRCA1/BRCA2肿瘤。ATR抑制剂最有希望的临床应用之一，是它们治疗PARP抑制剂耐药肿瘤的潜力。在DSBs处，通过不依赖BRCA1的RAD51，BRCA1缺陷型癌细胞可以克服PARP抑制剂的毒性 (框3)。在体外，ATR抑制剂阻断了这种不依赖BRCA1的功能，导致肿瘤细胞对PARP的抑制作用再敏感。此外，HR熟练和HR缺陷癌细胞中，ATR抑制剂逆转了解旋酶SLFN11失活引起的PARP抑制剂耐药。3.4 CHK1抑制剂
作为ATR的下游靶点，激酶CHK1同样被DNA复制缺陷激活。CHK1抑制剂选择性地杀死具有高水平复制应激的癌细胞。CHK1抑制剂显示可增强DNA损伤剂的细胞毒性，例如p53缺陷癌细胞中的吉西他滨、顺铂和喜树碱，以及p53缺陷的三阴性乳腺癌小鼠模型中的伊立替康。与ATR抑制剂类似，CHK1抑制剂会加剧PARP抑制造成的DNA损害。此外， CHK1抑制剂prexasertib治疗可激活I型干扰素信号，并且它与抗PDL1免疫疗法的结合在小细胞肺癌小鼠模型中产生协同抗肿瘤作用。尽管一些CHK1抑制剂在初始临床试验阶段表现出显著的毒性，几种安全性更好的新型候选化合物目前正在临床上进行测试(表1)。3.5 WEE1和PKMYT1抑制剂
酪氨酸激酶WEE1负责CDK1的抑制性磷酸化，可防止有丝分裂进入。因此，使用WEE1抑制剂治疗会导致有丝分裂异常进入，这是这些化合物的细胞毒性的基础。S期，通过SLX4–MUS81复合物和DNA损伤的毒性积累，CDK1激活还导致停滞复制叉的裂解增强。重要的是，伴随着组蛋白H3 Lys36三甲基化(H3K36me3)缺失，WEE1抑制是合成致死的，这经常在缺乏组蛋白甲基转移酶SETD2或过度表达组蛋白赖氨酸脱甲基酶KDM4A的癌症中发现。鉴于SETD2在癌症中经常发生突变，在异种移植模型和细胞系中获得的结果，提供了使用抗H3K36me3抗体作为鉴定SETD2突变的生物标志物的理论依据，其对WEE1抑制剂敏感，目前正在接受临床测试。最近，在CRISPR-Cas9筛选中发现，WEE1样激酶PKMYT1与细胞周期蛋白E过度表达的合成致死相互作用。表达细胞周期蛋白E的癌细胞中，用PKMYT1抑制剂RP-6306触发计划外的CDK1激活，并且该抑制剂在异种移植物或PDX模型中，表现出有效的体内抗肿瘤活性，单独使用或与吉西他滨联合使用。这抑制剂目前正在实体肿瘤患者的I期临床试验中进行测试 (表1)。
4 新兴疗法和新靶点
除了PARP1和本文前面讨论的激酶外，它们已被验证为癌症治疗的真正靶点(表1、2)，另外一些的DDR因子已被确定为特定肿瘤的潜在目标靶点。接下来，连同目前处于临床开发中的抑制剂化合物，将在以下小节中讨论。4.1 POLQ抑制剂靶向HR缺陷肿瘤
POLQ在替代末端连接通路中起着核心作用，该通路修复了具有内部微同源性的被切除的DNA末端 (图2)。POLQ包含一个解旋酶样的ATPase结构域，需要从切除的ssDNA末端取代RPA并解开同源序列。在排列和退火后，POLQ的聚合酶活性填充间隙，随后由LIG1或LIG3封闭。反映其在DNA修复中的关键作用，在一组不同体外肿瘤细胞系中POLQ抑制具有放射增敏作用。
发现POLQ与DNA修复基因的合成致死相互作用，包括BRCA1、BRCA2和ATM，强调了POLQ是消除伴有HR修复障碍的肿瘤的一个有希望的靶点。世界多个团队的共同努力完成了对POLQ抑制剂的鉴定，鉴定出两种化合物，在临床前研究中显示出疗效，目前正在为其设计临床试验。小分子文库筛选中，抗生素新生霉素被确定为一种特异且有效的POLQ抑制剂。新生霉素与POLQ的ATPase域的结合触发BRCA1/2缺陷细胞的消除，并增强PARP抑制剂的毒性作用。重要的是，在三阴性乳腺癌基因工程小鼠模型中新生霉素抑制BRCA1缺失肿瘤的生长，以及在PDX中，通过53BP1的丢失，获得具有PARP抑制剂耐药性，表明这种药独特的临床潜力。此外，PARP抑制剂耐药癌症中，高POLQ mRNA水平可能作为新生霉素敏感性的预测生物标志物。第二种POLQ抑制剂，ART558，在体外显示出纳米摩尔级POLQ亲和力，并特异性抑制BRCA2缺陷细胞的生长，其概述了POLQ基因消融的效果。类似于新生霉素，ART558对BRCA1−/−细胞和来自BRCA1突变的乳腺癌类器官具有毒性，这些细胞已对PARP抑制剂产生耐药性。虽然该抑制剂的体内数据还没获得，但同一公司开发的另一种POLQ抑制剂ART812，在动物模型中具有更高的生物利用度和较低的清除率，在大鼠中能够抑制PARP抑制剂耐药BRCA1-/-肿瘤的生长。4.2 USP1抑制剂靶向BRCA1/2缺陷肿瘤
去泛素化酶USP1是翻译合成（逆转增殖细胞核抗原(PCNA) 的泛素化）的负调节因子。PCNA泛素化是翻译合成进行复制后DNA修复所必须的。USP1失活后使复制叉不稳定，单泛素化PCNA持续存在，变得依赖BRCA1。因此，癌细胞中USP1失活伴随BRCA1丢失是合成致死的。最近开发的USP1抑制剂KSQ-4279专门针对BRCA1/2缺陷癌细胞。重要的是，三阴性乳腺癌的PDX模型中，无论BRCA1/2状态如何，其与PARP抑制剂联合导致了抗肿瘤反应延长。KSQ-4279目前正在对患有晚期实体瘤的患者进行I期临床试验。4.3 RAD51抑制剂
RAD51是DSB修复HR通路的中心酶，对细胞存活至关重要。RAD51在被切除的DSBs上形成的ssDNA上组装核蛋白丝，它催化链入侵转化为同源DNA模板以启动HR修复。BRCA2是RAD51在DSB位点的加载子，并且正如预期的那样，RAD51的废除与PARP抑制是合成致死的。在体内外，发现了几种调节RAD51活性并防止RAD51细丝形成和/或已确定抑制HR修复的化合物。RAD51抑制剂CYT-0851对活化诱导胞苷脱氨酶(AID)表达的慢性淋巴细胞白血病小鼠模型和人类癌症细胞具有选择性细胞毒活性，目前正处于I/II期临床试验中，单独或联合使用化疗，用于治疗B细胞血液系统恶性肿瘤和晚期实体瘤。4.4 微卫星不稳定性癌症中，靶向解旋酶WRN
微卫星不稳定性(MSI)是MMR缺陷癌症的常见标志 (例如，MLH1、MSH2、MSH3或MSH6基因突变)，并且常见于胃(~28%)、子宫(~22%)和结直肠(~15%)癌症。解旋酶WRN是MSI细胞中的合成致死靶点，特别是在遗传性非息肉性结肠癌中。然而，仅MMR基因的失活不足以解释观察到的合成致死相互作用。相反，长期MMR缺陷导致大量TA二核苷酸重复的积累，形成非B-DNA二级结构。在WRN缺失的情况下，SLX4–MUS81核酸内切酶复合物切割这些结构，导致染色体断裂和细胞凋亡。所以，MSI阳性癌症人群，抑制WRN解旋酶活性可能是一种有效的可选择的治疗方法。
DDR网络高度协调，以确保在涉及DNA代谢反应的细胞过程中染色体的完整性 (复制和修复)。鉴于这些活动对于细胞生存和增殖来说是必不可少的，很早就清楚的一点，即靶向DDR可能是抑制癌细胞生长的可行策略胞。应用这种方法明显存在的挑战是在肿瘤中特异性靶向DDR，而正常组织不受影响。伴随着对促进肿瘤生长的特定基因改变的鉴定成功，在应对这一挑战方面取得了实质性进展，同时在这种特定的遗传背景下，使肿瘤容易受到具有选择性毒性的DDR靶向治疗的影响。作为肿瘤中BRCA1/BRCA2突变与PARP抑制剂之间合成致死相互作用的典型范例，说明了这一概念。应用相同的原理，多个研究已经确定了在癌症中发生突变的其他DDR基因之间的合成致死相互作用，从而为携带这些突变的肿瘤提供潜在的药物靶点。然而，事实证明，该方法很麻烦。这是因为BRCA1/BRCA2突变细胞和肿瘤对PARP抑制剂的显著超敏反应具有三个独特的因素：(1)PARP抑制剂阻止未连接的冈崎片段加工，从而产生SSBs；(2)SSBs是癌症中最常见的DNA损伤，并且需要PARP1修复；(3) 使用PARP抑制剂治疗的BRCA1/2突变肿瘤中，未修复的SSBs会导致进一步的DNA损伤，进而触发强大的先天免疫反应。因此，其他合成-致死相互作用有可能无法成功复制PARP抑制剂对HR缺陷肿瘤有效作用。此外，大多数用于鉴定新的药物靶点的工具(例如，CRISPR-Cas9筛选) ，都在基因水平上监测合成致死相互作用。虽然这种方法可以鉴定新的药物靶点(例如，BRCA1缺陷癌细胞中的RNase H)，靶蛋白的缺失可能不会具有与其化学抑制作用一样强的抗癌作用。例如，PARP1抑制剂对HR缺陷癌症的细胞毒性被认为是由PARP1捕获介导的，而不是由PARP活性丧失介导的。在其他情况下，酶催化活性的丧失，比完全没有这种蛋白质更糟糕。例如，Atm基因敲除的小鼠虽然易患肿瘤，但仍能存活，而ATM催化位点突变的小鼠在胚胎期是致死的。DNA-PKcs激酶凋亡的小鼠也是如此，他们也是胚胎致死的，尽管缺乏DNA-PKcs的小鼠也可以存活。此外，DDR基因的失活会引发基因组不稳定，导致多个其他基因的改变，使其很难确定肿瘤的遗传起源。精准医学的出现，强调了在癌症患者中发现的特定基因改变，与针对这种改变的靶向治疗相匹配的好处。目的是最大限度地提高治疗效果，同时减少不利影响(即毒性和耐药性)。然而，近年来在精准医疗方面取得的进展，也揭示了任务的复杂性。例如，虽然能够对患者样本进行测序的技术很容易获得，对基因组学和转录组学数据进行反卷积和解释仍然是主要障碍。DDR突变肿瘤中，基因组不稳定性的另一个后果是，尽管进行了靶向治疗，为了逃避药物毒性，恢复肿瘤生长，它们进行基因构成的重新组合。这种现象被称为获得性耐药，至今仍是临床上难以逾越的障碍。设计药物组合，优化时机和给药方案，可降低毒性，限制或抑制耐药性，可以解决这些问题。在这个方面，DDR抑制剂与免疫检查点阻断联合使用是一种很有前途的治疗策略。DDR抑制剂造成的DNA损伤导致胞质DNA片段的积累(例如，以微核的形式)，激活cGAS–STING轴并触发抗肿瘤免疫反应。DDR和cGAS–STING通路与临床应用之间的相互作用，已在最近的其他评论中讨论过。如本评论中所讨论的，最近已经开发了多种靶向DDR通路的新型化合物，以及正在患者中评估那些临床前环境中显示有希望的药物。然而，重要的是要认识到，这种经验方法可能不适用于癌症等复杂疾病。因此，当务之急是集中精力研究发现药物开发的新靶点，以及通过卓越的配方或方法鉴定可减少副作用的有效药物组合，来优化现有药物并最大限度地提高临床疗效。| 自从发现聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制和BRCA1/2不足两者之间的合成致死相互作用以来，多项研究证明了PARP抑制剂的临床获益，特别是对于BRCA1/BRCA2突变的肿瘤患者。因此，六种不同的PARP抑制剂已获准用于临床，包括针对BRCA1/BRCA2突变癌症的特定亚群：奥拉帕尼，卢卡帕利，尼拉帕尼，他拉佐帕利，氟唑帕利和帕米帕利。例如，美国食品和药物管理局(FDA)已批准奥拉帕尼和他拉唑帕利用于治疗晚期或转移性HER2阴性乳腺癌患者。2022年3月，奥拉帕尼获FDA批准用于辅助治疗遗传性BRCA1/BRCA2突变和HER2阴性高危早期乳腺癌患者。PARP抑制剂也用于治疗患有BRCA1/BRCA2突变（胚系或体细胞突变）的卵巢癌患者，如维持治疗(奥拉帕尼)或化疗后的治疗(奥拉帕尼和卢卡帕利)。此外，奥拉帕尼用于BRCA1/BRCA2突变的转移胰腺癌患者的维持治疗。卢卡帕利则作为伴随BRCA1/BRCA2突变（胚系或体细胞突变）的转移性耐去势前列腺癌患者的二线治疗方案。PARP抑制剂的临床应用不仅限于BRCA1/BRCA2突变的肿瘤。奥拉帕尼和尼拉帕尼可用于靶向治疗同源性重组缺陷相关的晚期卵巢癌，该缺陷不仅由BRCA1/BRCA2突变定义，也通过经批准的伴随诊断测试评估的基因组不稳定性定义 (框2)。此外，奥拉帕尼批准用于治疗转移性去势抵抗前列腺癌患者，这些患者的肿瘤在抗雄激素治疗后出现肿瘤进展，并且在同源重组基因，包括BRCA1、BRCA2、PALB2、RAD51C、RAD51D和ATM中，存在胚系或体细胞突变。值得注意的是，PARP抑制剂也被批准用于复发或晚期卵巢癌(奥拉帕尼，卢卡帕利和尼拉帕尼) 患者的维持治疗，这些患者不是根据已知的BRCA1/BRCA2突变或同源重组缺陷而选择的。这些抑制剂也已被欧洲药品管理局(EMA) 批准治疗上文提到的某些肿瘤类型。此外，中国国家药品监督管理局(NMPA)已批准使用PARP抑制剂来治疗BRCA1/BRCA2突变的复发性卵巢癌(氟唑帕利)或BRCA1/BRCA2突变的复发性晚期卵巢癌(帕米帕利)。然而，PARP抑制剂耐药性的出现限制了它们的临床疗效(框2)。因为PARP捕获介导PARP抑制剂的抗肿瘤活性和获得性耐药性，因此调节它们的捕获能力可能会影响它们的临床疗效。因此，具有更高PARP捕获能力的新型PARP抑制剂，例如最近开发的维利帕尼衍生物，是有前途的临床候选药物。 |
框2 患者选择的生物标志物和功能分析 患者分层在靶向抗肿瘤疗法的开发和临床应用中具有关键作用，新型生物标志物的应用被用于确定患者是否会从给定的治疗中受益。胚系或体细胞突变的存在是患者选择的主要标准，如使用聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂靶向BRCA1-、BRCA2-或ATM突变的肿瘤(框1，表1、2)。其他测量复杂“基因组疤痕”的伴随诊断测试也被用来选择符合条件的患者。例如，一项伴随诊断测试测量杂合性的丢失，端粒等位基因失衡和大规模状态转换，并计算基因组不稳定性分数。 作为基因检测的替代方法，测量RAD51灶形成的功能测定，作为同源重组活性的替代品，已被证明可以预测PARP抑制剂的体外反应。实际上，来自上皮性卵巢癌患者的细胞，在体外PARP抑制剂卢卡帕利进行挑战，同基因分析中RAD51病灶的形成与细胞的存活相关。最近的研究表明，在福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤样本中进行RAD51病灶形成的可能性检测，从而消除了分离活癌细胞和治疗的需要。使用PARP抑制剂治疗的BRCA1/BRCA2胚系突变患者的福尔马林固定中的石蜡包埋肿瘤样本，进行功能同源重组分析，可预测临床疗效和耐药性。总而言之，RAD51焦点的形成是那些可能受益于PARP抑制剂患者的一个很有前途的工具选择。临床上，遗传和功能检测可能成为选择患者进行常规DNA损伤反应抑制剂治疗的方法。但是，功能分析仅适用于PARP抑制剂，未来的努力应该集中在预测其他DNA损伤反应靶向疗法功效的功能分析的研发。 |
| 在临床上，使用聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂的主要缺点是耐药疾病的出现。最近的体外研究，发现了几种可能是导致PARP抑制剂耐药的基因突变。然而，在患者中只发现了这些突变的一个子集。通过逆转突变，恢复开放阅读框重新激活BRCA1基因或BRCA2基因，是临床上PARP抑制剂耐药最常见的原因之一。通常，这是部分开放阅读框的修复，足以维持BRCA1/2的一些关键活动(例如，RAD51在双链断裂处加载)。散发性三阴性乳腺肿瘤中，BRCA1失活的一个常见机制是BRCA1启动子高甲基化，这是PARP抑制剂敏感性的预测因子。BRCA1沉默通过去甲基化被逆转，这使得残留转录足以引发耐药性。已有研究表明，耐药肿瘤重新表达BRCA1，同时保留BRCA1启动子超甲基化。其中一例是由染色体重排引起的，该重排将BRCA1基因置于异源活性启动子的控制下。针对BRCA1突变肿瘤的PARP抑制剂耐药的另一种机制，是通过废除53BP1或其相互作用的伙伴RIF1和shieldin复合体(即REV7、SHLD1、SHLD2和SHLD3)，进行同源重组的恢复。BRCA1缺陷细胞中，废除任何这些因素重新激活末端切除，并将双链断裂位点的RAD51负载提高到足以进行部分同源重组修复的水平。这种机制具有临床意义，因为在PARP抑制剂耐药的三阴性人类乳腺癌中发现了，编码53BP1通路成分的基因突变或下调。癌症患者中，独立于同源重组再激活的PARP抑制剂耐药机制也有报道。例如，聚(ADP-核糖)糖水解酶(PARG)的表达缺失，这种酶负责聚(ADP-核糖)链的降解，稳定聚(ADP-核糖基)链，并促进BRCA1/BRCA2缺陷细胞和肿瘤中的PARP抑制剂耐药。免疫组织化学检测到PARG抑制可能与广谱肿瘤相关。同样，解旋酶SLFN11的丢失，在DNA复制和修复中具有难以捉摸的作用，促进了BRCA1/2缺陷细胞中对PARP抑制剂的耐药性。一名PARP抑制剂耐药BRCA1缺失的转移性乳腺癌患者，报告了SLFN11错义突变。 |
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