前沿文献|《Nat Commun》IF:17.69|单细胞测序揭示肝癌与免疫细胞“锁-钥匙”特征

大家好，我是雪梨。又来给大家推送最新的单细胞测序文章解读~今天推送的是2022年12月份发表的《Multiregional single-cell dissection of tumor and immune cells reveals stable lock-and-key features in liver cancer》

研究背景：

肿瘤内异质性(ITH)是对人类癌症组织的多水平分析揭示了单个肿瘤内细胞之间的巨大分子异质性，并且普遍与患者的预后相关。由于肿瘤生态系统中的基质细胞和免疫细胞除了可能激活的免疫监视以限制肿瘤生长外，还可能与肿瘤细胞竞争空间和营养物质，因此肿瘤细胞可能会发展出独特的特征来重新编程肿瘤微环境(TME)以逃避竞争。由于肿瘤的进化伴随着肿瘤细胞和TME的持续相互作用，因此定义细胞特征及其潜在的分子通信网络可能是提高对肿瘤生态系统的分子理解和开发有效的实体肿瘤治疗方法的关键。

在本文中，假设每个肿瘤生态系统可能代表了在选择压力下丰富肿瘤-基质相互作用网络的独特组合，促进肿瘤进化的成功。因此，定义肿瘤和免疫/基质细胞的相互作用可能代表肿瘤生物学中稳定的独特指纹，这一特征类似于Emil Fischer在127年前提出的描述酶-底物相互作用的锁-钥匙模型。

研究方法:

对4例肝癌患者和3例ICCA患者的不同肿瘤大小的肝脏肿瘤标本进行了多区域单细胞转录组分析。为每个肿瘤制备了来自5个不同区域的单细胞，即3个肿瘤核(T1、T2和T3)。一个肿瘤边界(B)和一个相邻的正常组织(N)(图1a)。本研究共纳入34个样本。

研究结果：

首先Fig1展示样本的细胞分类结果t-SNE分析显示，恶性细胞形成患者特异性簇，与肿瘤区域无关(图1b和c)，表明，虽然肿瘤大小和组织学可能在患者之间有所不同，但患者内部肿瘤细胞转录组活性的差异要比患者之间的差异小。

RNA速度轨迹分析发现恶性细胞的细胞轨迹在每个肿瘤的不同肿瘤区域再次出现相似，而不同干性基因的表达存在异质性。采样区域之间的基因表达模式相似，而单个细胞之间的表达不同(图2b，补充图5)。对三个HCC样本使用冷冻保存的单细胞悬液荧光激活细胞分选(FACS)分析显示EPCAM 或GPC3 (已知升高两个标志物)细胞在肿瘤核心区域的比例相对稳定，但与肿瘤边缘区域相比存在差异，证实了SPP1在肿瘤细胞中异质性表达升高。

Fig3表示TMEs在多个肿瘤区域或患者之间的细胞模式相似，但存在微小差异(图3c, d)。T细胞转录组谱在不同采样区域之间表现稳定(图3e)。免疫组化分析进一步评估了CD3 T细胞的存在，在每个病例中，肿瘤核心和肿瘤边缘之间的CD3 T细胞数量与可用石蜡块之间的CD3 T细胞数量相对相似(补充图8)。不同采样区域的免疫/基质细胞类型的变化与肿瘤大小无关，与肿瘤细胞的特征相似(补充图9b)。

接着进入重点结果：

强调研究思路是假设每个肿瘤包含肿瘤细胞活动和每个患者独特的免疫细胞景观之间的特定分子通信网络

图4展示cellphonedb分析在每个患者中搜索恶性细胞和TME的配体-受体相互作用。结果显示这些网络在每个患者的不同肿瘤区域之间始终保持良好保守(图4a, b），无论采样位置如何，肿瘤的分子通信网络都相对稳定，HCC中的相互作用比iCCA更稳定(图4c)。确定了肿瘤细胞和t细胞亚群之间的相互作用，在每个病例中观察到相对稳定的相互作用(补充图12b, c)。每个患者有特定的细胞间通信网络(图4a和d)。通过随机样本的混合区分，发现肿瘤随机洗牌的网络交互强度比TME随机洗牌恶化得更快(图4f)。综上所述，这些结果表明每种肿瘤在肿瘤和TME之间可能包含相对稳定但独特的通信网络，其中恶性细胞主要是患者特异性模式的组成部分。

Fig5 展示恶性细胞和非恶性细胞的交流与患者的预后相关。基于在Fig4中发现的稳定的配体-受体，另外下载了25例HCC和12例iCCA患者的另外46例肿瘤样本中。基于配体-受体相互作用活性的层次关系，发现了两个具有不同相互作用网络的主要簇(图5a)。值得注意的是，两组患者的总生存率显著不同，这表明与肿瘤生物学相关的两组肿瘤-免疫相互作用网络在生物学上是不同的(图5b)。分别分析了HCC发现两个聚类之间的生存差异趋势一致(图5c)。

评估了两个簇中每个配体-受体相互作用的比例之间的差异。值得注意的是，配体-受体相互作用网络在两个簇之间极化(图5d)。Cluster 1中最主要的相互作用对LGALS9-SLC1A5和SPP1-PTGER4，主要由恶性细胞和TAMs的通讯贡献。

为了确认CellPhoneDB识别的配体-受体对，进一步应用CellChat来确定细胞相互作用。使用这两种方法发现肿瘤细胞和TAMs之间配体-受体相互作用(即SPP1-PTGER4和LGALS9-SLC1A5)的一致性为85%。

通过计算特定相互作用对中配体和受体的平均值，然后使用患者的中位数表达来确定这对的发生，以模拟肿瘤和TME之间的配体-受体相互作用。将该策略应用于所有已识别的配体-受体对，以生成每个患者的相互作用图，然后基于其进行分层聚类。

Fig6在LCI队列(图6a)以及TCGA HCC和TIGER-LC HCC队列(补充图15a)中的验证，患者可以分为两个具有不同相互作用模式的主要集群。为了评估三个队列之间通信模式的一致性，计算了所有三个队列中集群1中每个配体-受体对的比例。发现，在三个不同的队列中，被分配到集群1或集群2的对具有很高的一致性，特别是对于集群1中的肿瘤- TAM衍生对，即LGALS9- SLC1A5和SPP1-PTGER4对(图6b)。值得注意的是，来自这两组的患者在肿瘤组织中的总生存期始终不同，但在相邻的非肿瘤组织中却没有(图6c)。

Fig7 最后使用RNAscope多重荧光原位杂交法在TIGER-LC队列(HCC, n = 68)和LCI队列(HCC, n = 190)的石蜡块组成的组织微阵列中评估了代表肿瘤- TAM通信的前两对，测定了LGALS9- SLC1A5和SPP1-PTGER4的表达模式(图7b)。发现，在两个队列中，基于转录组的分析和基于RNAscope的分析之间，所有四个靶基因的表达水平都存在显著相关性，基于RNAscope信号发现两对具有高BC值的配对相关基因都有较高的共定位，这表明配对相关的两个基因是相互依赖的(图7e和补充图16b)。此外，偶相关基因共定位于某些肿瘤区域，而不是整个肿瘤空间(图7f和补充图16c)。与单细胞和大量转录组数据一致，在两个HCC队列中，两对高表达的患者的总生存率明显低于低表达组(图7g和补充图16d)。因此，两个配体受体对(LGALS9-SLC1A5和SPP1-PTGER4)的共存是稳定的，表达升高与HCC患者预后不良相关。

两个配体受体对相关的四个基因及其功能替代基因的表达之间存在显著相关性，结果表明存在一种独特而稳定的肿瘤-巨噬细胞信号活性，代表与HCC侵袭性相关的特定配体-受体相互作用下游的独特特征。

总结：

综合来说，这是一篇主要从细胞间通信作为主要思路分析，样本取了多部位采样，还有很多新颖的的分析方法，例如通过随机样本的混合分析，分析受体配体的主要细胞来源，在验证阶段，不仅引入单细胞层面，还有RNA-Seq数据库的分析的数据去验证具有不同相互作用网络的主要簇患者分层的预后影响。最后实验RNAscope多重荧光原位杂交法选择了两对的最显著的受体配体对验证，整篇文章一气呵成。借用“钥匙-锁”的概念去写这个文章，不仅科研感满满，故事性也很强！

参考文献：Ma L,Heinrich S,Wang L, et al. Multiregional single-cell dissection of tumor and immune cells reveals stable lock-and-key features in liver cancer. Nat Commun. 2022;13 (1):7533. doi:10.1038/s41467-022-35291-5