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IHC实验操作视频
Experimental operation video
取材固定→切片→脱蜡至水→灭活→抗原修复→封闭→一抗孵育→二抗孵育→显色→复染→封片
/ IHC实验操作视频/
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IHC实验产品清单
List of experimental products
实验步骤 | 产品名称 | 产品货号 |
| 组织固定 | 组织固定液 | AR1068 |
| 切片 | 防脱玻片 | AR1065 |
| 灭活 | 内源性过氧化物酶阳断剂 | AR1108 |
| 抗原修复 | EDTA抗原修复液 | AR0023 |
柠檬酸盐修复液 | AR0024 | |
| 清洗 | PBS缓冲液 | AR0030 |
| 封闭 | 5%BSA | AR0004 |
| 二抗解育 | 多聚体抗小鼠IgG-HRP | SV0001 |
多聚体抗免gG-HRP | SV0002 | |
| 显色 | DAB显色试剂重 | AR1027 |
| 复染 | Mayer~S苏木素 | AR0005 |
| 封片 | 中性树胶 | AR0038 |
注：点击产品货号查看产品详情
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IHC实验操作步骤
Experimental operation steps
第一步：切片
1.石蜡切片厚度5微米；
2.40℃水温展平组织后防脱玻片捞片；
3.60℃烘箱，烤片30min。
注意事项：
对于骨或皮肤这些易脱片的组织，可适当延长烤片时间。
第二步：脱蜡至水
1.二甲苯脱蜡，3缸，每缸10min；
2.100%、85%、70%酒精，各浸泡10min。
注意事项：
具体时间需根据室温和二甲苯的新旧程度灵活调整，室温越高，二甲苯越新，相应浸泡时间越短，以组织上无点状石蜡残留为准。
第三步：灭活
1.滴加内源性过氧化物酶阻断液；
2.室温孵育10min；
3.PBS缓冲液水洗3次，每次5min。
注意事项：
对于内源性过氧化物酶含量高的组织，可以适当延长孵育时间或增加过氧化氢浓度。
第四步：抗原修复
EDTA微波热修复5~8min，冷却至室温。
注意事项：
对大部分蛋白来说，EDTA修复液一般都能得到满意的结果。也可使用传统的柠檬酸盐修复液。样本固定时间过久或阳性表达不强，可以适当增加修复的次数和强度。
第五步：封闭
1.免疫组化笔画圈，防止试剂流出；
2.滴加5%BSA或者封闭血清；
3.37℃孵育30min。
第六步：孵育一抗
1.甩去多余液体，不洗，直接滴加一抗；
2.37℃孵育1-2h；
3.PBS缓冲液清洗3遍，每次5min。
注意事项：
初次实验，建议一抗做浓度梯度，以确定最佳的一抗稀释比例。
第七步：孵育二抗
1.滴加HRP标记羊抗兔；
2.37℃孵育30min；
3.PBS缓冲液清洗3遍，每次5min。
注意事项：
根据一抗种属决定二抗的类型，比如一抗为兔抗，那二抗选择HRP标记的羊抗兔IgG。
第八步：显色
1.配置DAB，1ml B液 1滴A液，混匀；
2.滴加DAB显色液；
3.镜下观察，控制显色时间；
4.终止反应；
5.水洗。
第九步：苏木素复染
1.苏木素复染40s；
2.蒸馏水水洗；
3.返蓝液浸泡1min；
4.水洗。
第十步：封片
1.70%、85%、100%酒精梯度脱水，每缸3min；
2.二甲苯透明，三缸，每缸3min；
3.晾干后，中性树胶封片，观察实验结果及拍照。
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IHC实验常见问题
Frequently Asked Questions
1.无染色
可能原因 | 解决方法 |
| 一抗和二抗不匹配 | 使用针对一抗的二抗（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体） |
| 没有足够的一抗与目标蛋白结合 | 提高一抗用量。延长4℃孵育时间（如过夜） |
| 由于不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效 | 做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性 |
| 样本中没有目标蛋白 | 建议做阳性对照 |
| 目标蛋白含量太少 | 应用信号放大操作 |
| 脱蜡不彻底 | 延长脱蜡时间，更换二甲苯 |
| 固定液封闭了抗体识别表位 | 缩短固定时间，加强抗原修复 |
| 蛋白位于细胞核内（核蛋白），抗体不能穿透核膜 | 对样本进行破膜通透处理 |
| PBS缓冲液被细菌污染后破坏了靶蛋白的磷酸根 | 在抗体PBS储存液中加入适量防腐剂，或使用新鲜无菌的PBS |
2.高背景
可能原因 | 解决方法 |
| 封闭不充分 | 选择合适的封闭液，延长封闭时间 |
| 一抗浓度过高 | 针对一抗做浓度梯度实验，选择合适浓度 |
| 孵育温度过高，时间过长 | 选择4℃过夜或缩短孵育时间 |
| 二抗质量不佳 | 不加一抗，做二抗对照，选择合格二抗 |
| 组织冲洗不彻底 | 加强洗涤 |
| 内源性过氧化物酶含量过高 | 延长3%H2O2灭活时间或用0.5%高碘酸溶液室温孵育10min |
| 固定过度 | 改变抗原修复方法或减小抗原修复强度 |
| 信号过度放大 | 缩短抗体孵育时间 |
| 通透作用破坏膜并除去了膜蛋白 | 去除缓冲液中的通透剂 |
| 显色底物过量或显色时间太长 | 缩短底物孵育时间 |
3.非特异性染色
可能原因 | 解决方法 |
| 一抗/二抗浓度过高 | 降低抗体浓度和或缩短孵育时间 |
| 存在内源性过氧化物酶活性 | 延长3%H2O2灭活时间或用0.5%高碘酸溶液室温孵育10min |
| 一抗与被染组织同源(如用鼠一抗检测鼠组织)，加二抗后，二抗会与同源的所有组织结合 | 应用与组织非同源的一抗 |
| 切片/细胞变干 | 保持切片/细胞湿度，切勿变干 |
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博士德IHC实验图
Appreciation of Experimental Legends
a-SMA 人肺癌
BAX 人肝癌
BCL-2 人淋巴瘤
CD8 人乳腺癌
CD41 小鼠肺
CD163 人肺癌
COL2A1大鼠膝关节
COL2A1小鼠膝关节
COL3A1 人肺癌
GFAP 大鼠脑
GFAP 小鼠脑
GFAP 小鼠海马
PCNA 人乳腺癌
TH 小鼠脑
Vimentin 人肺癌
E-cadherin人肺癌
E-cadherin人乳腺癌
IBA1 小鼠脑
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