手把手，一步步教你做基础实验操作之免疫荧光（内含个人经验避坑总结）

免疫荧光（immunofluorescence）是一种广泛应用于科研和临床诊断的实验室技术，基于抗原抗体特异性结合，通过荧光素直接或间接偶联抗体，利用荧光或共聚焦显微镜可视化观测靶标分子，根据荧光强度与表达位置确定靶标分子在细胞或组织中的表达丰度以及定位。

具体操作步骤：组织---制备切片---抗原修复、封闭、抗体杂交---DAPI核染、封片---拍照、图像分析

PART.01

相关试剂配比

柠檬酸修复液（10×）：柠檬酸    8g     柠檬酸三钠     60g     去离子水定容至2L

PBS（10×）：Nacl    160g     Kcl   4g    Na2Hpo4   28.4g    K2Po4    5.4g   定容至2L

一抗稀释液的准备：推荐专属抗体稀释液，也可选用 3%BSA 的 PBS 或者 PBS 作为一抗稀释液。 

一抗的稀释：按照一抗说明书中推荐的用于免疫荧光染色的稀释比例用一抗稀释液稀释一抗。 

荧光标记二抗的稀释：推荐使用专属抗体稀释液，也可选用 3%BSA 的 PBS 或者 PBS 作为抗体稀释液；根据荧光的强弱，稀释的比例可以适当提高或降低。

PART.02

石蜡切片

具体操作（冰箱里拿出需室温放置30分钟至1小时；捞片需架子上室温晾干10分钟后烘箱烘烤2-3小时）

01

脱蜡

二甲苯I     10分钟

二甲苯II     10分钟

二甲苯III    10分钟

02

复水

无水乙醇I   5分钟

无水乙醇II  5分钟

95%乙醇I   5分钟

95%乙醇II  5分钟

80%乙醇    5分钟

75%乙醇    5分钟

放入烧杯中蒸馏水冲洗2次，各3分钟

PBST溶液冲洗3次，各5分钟

03

抗原修复

放进修复液一定要温柔放置脱片，EDTA比柠檬酸容易脱片

可使用EDTA（PH：9.0）或柠檬酸修复液（PH：6.0）使用前预热至95-100℃，放入切片加热约15分钟，室温冷却30分钟。（具体修复液类型参考一抗说明书）

PBST冲洗3次，每次5分钟。擦干水分。

04

灭活

3%过氧化氢  37度恒温箱内10分钟。

PBST冲洗3次，每次5分钟。擦干水分。

05

封闭

5%BSA封闭，37℃封闭60分钟。去除后不需要清洗。

06

一抗孵育

去除封闭液，用稀释的特定一抗湿盒内 37°C 孵育 60 分钟，可以在摇床上轻轻摇动。为增强与一抗的结合，可以 4°C 冰箱中过夜。 

去除一抗，用 PBST 工作液洗涤 3~5 次，每次 3~5 分钟。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。

07

二抗孵育

去除 PBST 工作液，加入 100 μL 稀释好的荧光标记的二抗湿盒内 37°C 避光孵育 60 分钟。 

PBST 工作液洗涤 3~5 次，每次 3~5 分钟，期间适当注意避光操作。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。

08

复染核

滴加 DAPI 染色液避光孵育 5 min，对标本进行染核，PBST 工作液洗涤玻片 5 分钟，洗涤 4 次去除多余的 DAPI 染色液。 

09

封片

滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上盖玻片，尽量避免气泡。如果一抗选用适当，在荧光显微镜下可以观察到绿色的荧光。

PART.03

细胞免疫荧光

试剂准备

固定液的准备： 推荐使用 4%多聚甲醛作为固定液，或根据特定的一抗或样品采用有效成分为乙醇、甲醇或其它类型的固定液。

通透液工作液准备： 使用 Triton X-100 作为通透液，用 1x PBS buffer 稀释成 0.5% Triton X-100 工作液。

01

贴壁细胞

具体步骤

1. 取普通洁净盖玻片于 70%乙醇中浸泡 5 分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级 PBS 或 0.9% NaCl 等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。

2. 将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为 50%~80%满。

3. 按照特定的实验目的处理细胞后，吸尽培养液，加入 1 mL 固定液，室温固定 15-30 分钟或更长时间。

4. 去固定液，用 PBST 工作液洗 3 次，每次 3~5 分钟，吸尽液体；洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

5. 使用 0.5% Triton X-100 室温通透细胞 15 min（细胞膜上表达的抗原可省略此步骤），1×PBST 浸洗玻片 3 次，每次 3min。

6. 用正常山羊血清封闭液封闭 30 分钟，可以在摇床上轻轻摇动。

7. 去除封闭液，用稀释的特定一抗湿盒内 37°C 避光孵育 60 分钟，可以在摇床上轻轻摇动。为增强与一抗的结合，可以 4°C 冰箱内孵育过夜。

8. 去除一抗，用 PBST 工作液洗涤 3~5 次，每次 3~5 分钟。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。

9. 去除 PBST 工作液，在盖玻片上加入 100 μL 稀释好的荧光标记的二抗湿盒内 37°C 避光孵育 60 分钟。PBST 工作液洗涤 3~5 次，每次 3~5 分钟，期间适当注意避光操作。

10. 复染核：滴加 DAPI 染色液避光孵育 5 min，对标本进行染核，PBST 工作液洗涤玻片 5 分钟，洗涤 4 次去除多余的 DAPI 染色液。

11. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片， 尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。

12. 如果一抗选用适当，在荧光显微镜下可以观察到绿色的荧光。

02

悬浮细胞

具体步骤

1. 离心收集细胞样品于 1.5 ml 离心管内，吸除上清后轻轻弹散细胞。

2. 加入 0.5 ml 固定液，缓缓悬起细胞，室温固定 15-30 分钟或更长时间。

3. 离心去固定液，用 PBST 工作液洗 3 次，每次 3~5 分钟（每次均需离心后吸去PBST）。洗涤期间可以用手或摇床轻轻晃动。

4. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约 50 μL 液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

5. 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。如果条件许可，可以使用适当的离心机，通过离心把细胞贴紧在载玻片上。

6. 使用 0.5% Triton X-100 室温通透细胞 15 min（细胞膜上表达的抗原可省略此步骤），1×PBST 浸洗玻片 3 次，每次 3min。

7. 用正常山羊血清封闭液封闭 30 分钟。

8. 去封闭液，用稀释后的特定一抗湿盒内 37°C 避光孵育 60 分钟。为增强与一抗的结合，可以 4°C 冰箱内孵育过夜。

9. 去除一抗，用 PBST 工作液洗涤 3~5 次，每次 3~5 分钟。

10. 去除 PBST 工作液，加入 100 μL 稀释好的荧光标记的二抗湿盒内 37°C 避光孵育 60 分钟。

11. PBST 工作液洗涤 3~5 次，每次 3~5 分钟，期间适当注意避光操作。

12. 复染核：滴加 DAPI 染色液避光孵育 5 min，对标本进行染核，PBST 工作液洗涤玻片 5 分钟，洗涤 4 次去除多余的 DAPI 染色液。

13. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上盖玻片，尽量避免气泡。

14. 如果一抗选用适当，在荧光显微镜下可以观察到绿色的荧光。

PART.06

注意事项

1. 尽量选用新鲜制备的样本；确定样品中抗原分子的表达丰度。

2. 细胞/冰冻切片检测胞内蛋白或抗原表位在胞内的膜蛋白需要进行通透处理；如果检测抗原表位位于胞外段的是跨膜蛋白，则不需要进行通透处理；采用丙酮固定组织的切片，因丙酮本身具有通透作用，不需要额外的通透操作。

3. 选择适用于免疫荧光的抗体；通过实验确定最佳稀释比例。

4. 选用二抗应匹配一抗来源物种；多指标共染时，注意一抗必须来源不同物种；共染时选择二抗荧光峰值相差大的荧光标记二抗以免串色。

5. 注意湿盒的保湿效果，避免样品的干燥。

6. 流水清洗切片时，不能直接对着切片冲，以免脱片；细胞和冰冻切片比较脆弱，洗涤时转速要温和。

7.合理设置实验对照组，排查抗体的特异性，以及是否存在自发荧光。

8.建议选用二抗种属来源的动物血清作为封闭液。

9. 从孵育二抗开始，注意避光操作，尤其是紫外光的照射，以免荧光淬灭导致假阴性结果。

常见问题及解决方案可参考：

IF│常见问题及解决方案，注意事项

END

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