JCI丨乳酸通过抑制巨噬细胞ATP6V0d2表达促进HIF-2α介导的肿瘤发展

大家好，今天给大家推荐的是华中科技大学同济医学院杨想平教授课题组2019年发表于JCI上的一篇文献，题目为Lactate inhibits ATP6V0d2 expression in tumor-associated macrophages to promote HIF-2α–mediated tumor progression。

原文链接https://doi.org/10.1172/JCI123027。

肿瘤微环境（TME）非常复杂，包括细胞外基质、肿瘤细胞、间充质细胞以及浸润的免疫细胞比如肿瘤相关巨噬细胞（TAM）等，它们之间相互作用以调控肿瘤发展。其中，TAM在TME中数量很多，而TME中的细胞因子和代谢中间物对于促进TAM的功能有非常重要的作用。

本研究发现肿瘤来源的乳酸通过激活巨噬细胞中的mTORC1，抑制了下游的转录因子TFEB的活性，从而抑制ATP6V0d2介导的HIF-2α溶酶体降解, 促进肿瘤发展。

囊泡水解酶（V-ATPase）是一个由14个亚单位组成的大分子复合物, 对于溶酶体的酸化和功能至关重要。在高度酸化的TME中，V-ATPase通过调控肿瘤细胞中Wnt、Notch和mTOR等信号促进增殖和转移。但是V-ATPase在TME的其他细胞中的功能还不清楚。

为了研究肿瘤细胞对骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）中V-ATPase的影响，作者使用两种肿瘤条件性培养基（TCM）处理BMDM，然后检测了V-ATPase所有亚基的表达，发现只有Atp6v0d2明显下调。而无论是添加阻断抗体还是将TCM煮沸，对TCM引起的Atp6v0d2表达下调都没有影响。因此，在TCM中发挥作用的物质是热稳定的，有可能是小分子代谢物。

Fig1. TCM抑制BMDM中Atp6v0d2表达

乳酸是肿瘤细胞糖酵解的代谢产物，在TME中能够大量积累。作者发现之前使用的TCM中乳酸含量分别为34.5 mM和45.2 mM。因此发挥作用的物质可能为乳酸。为了检测乳酸对于Atp6v0d2表达的影响，作者使用不同浓度的乳酸处理BMDM，发现乳酸的确能够抑制Atp6v0d2表达，并呈浓度依赖。乳酸进入BMDM依赖于单羧酸转运体MCT，作者使用TCM处理BMDM时加入MCT的抑制剂，发现Atp6v0d2表达不再下调，因此确定TCM中发挥作用的确实是乳酸。

Fig2. TCM中乳酸浓度（左），乳酸抑制BMDM中Atp6v0d2表达（右）

Atp6v0d2是TFEB的靶基因。TFEB是溶酶体生物发生的主要调节基因，可被mTORC1磷酸化，磷酸化的TFEB会停留在细胞质并保持失活状态。乳酸抑制Atp6v0d2是否通过激活mTORC1呢？作者发现使用TCM和乳酸处理BMDM都能够促进mTORC1激活，而TFEB的核定位以及在Atp6v0d2启动子区的结合都显著下降。加入mTORC1抑制剂将不再抑制Atp6v0d2表达。

Fig3. TCM和乳酸激活BMDM中的mTORC1

为了探究巨噬细胞的ATP6V0d2在肿瘤增殖中的作用，作者在野生型和Atp6v0d2敲除小鼠中荷瘤，发现敲除小鼠的肿瘤体积明显比野生型大，表明ATP6V0d2能够抑制肿瘤细胞增殖。巨噬细胞表达ATP6V0d2，而T细胞和肿瘤细胞等细胞中则不表达。为了确认Atp6v0d2敲除引起的肿瘤增殖是由于影响了巨噬细胞的功能，作者将野生型和敲除Atp6v0d2的BMDM与肿瘤细胞一起注射进小鼠，发现注射了敲除Atp6v0d2的BMDM的小鼠肿瘤体积更大。这些结果说明，巨噬细胞中表达的ATP6V0d2抑制了肿瘤的生长。此外，作者使用肺转移模型发现ATP6V0d2能够抑制肿瘤的转移和存活，以及促癌巨噬细胞的浸润。继续探究发现ATP6V0d2的存在抑制了促癌巨噬细胞的极化及其相关因子的表达。

Fig4. 敲除Atp6v0d2的BMDM的小鼠肿瘤体积更大

为什么敲除Atp6v0d2的小鼠中肿瘤生长加快呢？作者发现敲除Atp6v0d2小鼠的肿瘤组织中血管生成增多，这一现象是由于巨噬细胞VEGF表达增加。ATP6V0d2如何调控VEGF表达呢？HIF-1α和HIF-2α是肿瘤发展过程中诱导VEGF表达的主要的转录因子。检测发现，敲除Atp6v0d2的巨噬细胞中HIF-1α和HIF-2α的mRNA没有变化，而HIF-2α蛋白表达增加。因此，ATP6V0d2是通过调控HIF-2α的稳定性调控蛋白表达的。使用蛋白酶体和溶酶体的抑制剂发现，只有溶酶体抑制剂增加了野生型中HIF-2α蛋白量，而对敲除Atp6v0d2细胞中的HIF-2α的量没有影响。这个结果说明，ATP6V0d2是通过促进溶酶体功能介导HIF-2α的降解。使用HIF-2α的抑制剂逆转了敲除Atp6v0d2与否导致的肿瘤细胞增殖的不同。

Fig5. Atp6v0d2敲除促进TAM中Vegf表达

为了探究ATP6V0d2介导的HIF-2α溶酶体降解在人类癌症中的作用，作者根据巨噬细胞ATP6V0d2表达高低将肺腺癌组织分为两组，发现在ATP6V0d2低表达的这一组里，促癌的巨噬细胞数目和HIF-2α的表达都多于另一组。而高表达ATP6V0d2或者低表达HIF-2α的病人存活时间更长。这些表明巨噬细胞中ATP6V0d2介导的HIF-2α溶酶体降解与肺腺癌病人存活相关。

该研究不仅揭示了肿瘤微环境中乳酸调控巨噬细胞极化的新机制, 还发现ATP6V0d2表达的高低可以作为肺腺癌重要的预后标志, 具有重要临床意义。