文档序号：17467610发布日期：2019-04-20 05:36阅读：12029来源：国知局
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本发明涉及核酸检测方法，具体涉及临床样品中检测核酸的方法。
背景技术：特异性检测核酸分子极具应用价值，比如病原体，遗传病，食品，环境等检测。传统的核酸检测方法是sourthern和northern，但操作繁杂。目前常用的核酸检测方法是pcr或荧光定量pcr，但是操作繁杂而且要借助仪器。传统的体外dna扩增主要是基于pcr方法，已经广泛应用于生物领域。pcr是由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，需要温度的变化才能完成，变性需要90-95℃加热，退火需要加热至50-65℃，延伸需要提高到70-75℃。扩增反应借助pcr仪，鉴定需要凝胶电泳，共耗时1.5h以上。因此需要一种简便的检测核酸方法。在olafpiepenburgetal(dnadetectionusingrecombinationproteins,plosbiologyvol4,no7,pe204)中提供一种等温扩增核酸的方法(rpa)。uvsx与引物结合形成的蛋白质-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应并启动dna合成，被替换的dna链与gp32结合，防止进一步替换。bsu对模板上的目标区域进行指数式扩增，uvsy辅助uvsx作用。整个过程非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。但是rpa扩增引物可能出现非特异性结合，产生非特异性目的条带。 张峰等基于cas13a的旁路活性建立快速检测rna的方法(jonathans.gootenbergetal,nucleicaciddetectionwithcrispr-cas13a/c2c2,science)。基本原理是向导rna引导cas13a蛋白特异识别目标核酸，cas13a蛋白识别核酸后就“切割”任意核酸，体系探针核酸就会发出荧光，信号放大从而达到检测目的。但是在该方法中cas13a识别的是rna，由于rna不稳定，操作难度非常大，而且多一步转录的步骤。杜娜等基于cas12a的旁路活性建立快速检测dna的方法,janices.chenet.alcrispr-cas12atargetbindingunleashesindiscriminatesingle-strandeddnaseactivity,science)。该方法先利用rpa等温扩增核酸，然后利用cas12a蛋白检测目标核酸，需要两步反应，操作不简便，而且读取最终结果需要荧光酶标仪，依赖仪器，不适合家居和野外检测。 技术实现要素： 本发明目的是针对现有技术的不足，创新性地将rpa等温扩增和cas检测合为一个步骤，并且以试纸条的形式呈现检测结果，操作简便、时间短，无需仪器，等温反应即可。 本发明提供一种简便检测核酸的试剂盒，其特征在于包含以下成分：uvsx蛋白，uvsy蛋白，gp32蛋白，bsu蛋白，cas12a，上游引物,下游引物(针对待检测的dna或rna设计)，向导rna(针对待检测的dna或rna设计)，核酸探针，hepes，乙酸钾，乙酸镁，dtt，peg-20000，dntps，atp，nacl，磷酸肌酸，肌酸激酶，任选地，还包括rna反转录酶，rnase抑制剂。 进一步地，按25μl反应体系计，各组分配制成如下：uvsx蛋白(50-200ng/μl)，uvsy蛋白(50-200ng/μl)，gp32蛋白(50-200ng/μl)，bsu蛋白(50-200ng/μl)，cas12a(0.1-0.5μm)，上游引物(400nm),下游引物(400nm)，向导rna(0.25-0.5μm)，核酸探针(0.25-0.5μm)，10-40mmhepes，25-200mm乙酸钾，10-20mm乙酸镁，1-3mmdtt，1-5％peg-20000，100-300μmdntps，1-5mmatp，20-100mmnacl，20-100mm磷酸肌酸，20-200ng/μl肌酸激酶。如果是检测的是rna样品，则需要进一步加入rna反转录酶1μl。 优选地，uvsx蛋白、uvsy蛋白、gp32蛋白分别来自为t4噬菌体或t6噬菌体。例如，uvsx蛋白为t4噬菌体或t6噬菌体uvsx或大肠杆菌reca蛋白或酵母的rad51蛋白或类似的链置换蛋白；uvsy蛋白为t4噬菌体或t6噬菌体uvsy蛋白或大肠杆菌recf、reco、recr蛋白或酵母的rad52蛋白；gp32蛋白为t4噬菌体或t6噬菌体gp32或大肠杆菌ssb蛋白或酵母的rpa蛋白或类似的链置换蛋白；所述的bsu蛋白为枯草芽胞杆菌bsu蛋白或类似的dna聚合酶。 进一步地，bsu蛋白为枯草芽胞杆菌bsu蛋白或类似的dna聚合酶，cas12a蛋白为具有旁路切割dna活性的cas蛋白。 其中，加入rna反转录酶可以实现对rna的检测，rna反转录酶为m-mlv酶活或其他类似的反转录酶。 所述核酸探针是带有荧光基团经大于两个碱基连接的biotin。例如是5’fam-(nn)n-biotin3’，n代表atgc中任意碱基，n大于2，优选为n等于5，更优选如3’fam-ttatt-biotin3’。其中，fam可以用tex或joe或cy5或cy3或hex或tamra等荧光基团代替。 本发明还提供一种简便检测核酸方法，其是采用上述试剂盒，与待检核酸样品于30℃-45℃加热15-60分钟，随后即可对dna和rna的进行检测。优选地，加热温度为35-40℃，进一步优选为36－38℃，最优选为37℃，加热时间优选为20-60分钟，更优选为30-50分钟。 其中，检测结果以试纸条或胶体金的形式呈现可视化检测结果，进一步地，所述试纸条或胶体金的形式可以检测fam或tex或joe或cy5或cy3或hex或tamra等荧光基团。 本发明的原理在于，如果引物对能够成功针对待检测核酸获得扩增产物，则向导rna将引导cas蛋白识别扩增产物，识别之后cas蛋白发生结构变化，就能切割任意核酸，加入的核酸探针如fam-ttatt-biotin就被切断，被切断的核酸探针就在胶体金上显示两道杠，即可判断为阳性。如果不能成功扩增获得产物，则向导rna也就不会引导cas蛋白，cas蛋白结构不发生变化就不能切割任意核酸，加入的核酸探针如fam-ttatt-biotin保持完整，进而通过胶体金上显示一道杠，即可判断为阴性。 本发明巧妙的运用上述原理，通过相关试剂的巧妙组合，创新性地将rpa等温扩增和cas检测合为一个步骤，反应时间短，操作简单方便。进一步地，以试纸条的形式呈现检测结果，操作简便，无需仪器，具有很强的适用范围和场所，实用性极强。 附图说明 图1牛腹泻病毒检测结果。 图2β-actin检测结果。 具体实施方式 下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，其不构成对本发明的限制。 实施例一：以牛腹泻病毒为例(rna样本) 1.提取：从牛血清中提取rna，作为待检核酸，提取方法按常规方法进行。 2.加样：25μl反应体系中包含uvsx蛋白(100ng/μl)，uvsy蛋白(100ng/μl)，gp32蛋白(100ng/μl)，bsu蛋白(100ng/μl)，cas12a(0.25μm)，上游引物(400nm，序列为5’ggggagtcgtcaatggttcgacac3’)，下游引物(400nm，序列为5’taactccatgtgccatgtacagcagag3’)，向导rna(0.25μm，序列为5’uaauuucuacuguuguagaucuagcggaauagcaggucuc3’)，核酸探针(0.25μm，5’fam-ttatt-biotin3’)，25mmhepes，50mm乙酸钾，10mm乙酸镁，2mmdtt，2％peg-20000，150μmdntps，2mmatp，30mmnacl，40mm磷酸肌酸，50ng/μl肌酸激酶，rna反转录酶1μl，rnase抑制剂(1-2μl)，待检核酸1μl。 3.将反应体系于37℃加热50分钟。 4.检测：用胶体金检测，右边除下面那一道杠外，上面还有一道杠(如箭头所指位置)，为阳性；左边仅下面有一道杠，而上面无杠(如箭头所指位置)，为阴性对照。 实施例二：以β-actin为例(dna样本) 1.提取：从血液中提取dna，作为待检核酸，提取方法按常规方法进行。 2.加样：25μl反应体系中包含uvsx蛋白(100ng/μl)，uvsy蛋白(100ng/μl)，gp32蛋白(100ng/μl)，bsu蛋白(100ng/μl)，cas12a(0.25μm)，上游引物(400nm，序列为5’tccatcctggcctcgctgt3’)，下游引物(400nm，序列为5’gctgtcaccttcaccgttc3’)，向导rna(0.25-0.5μm，序列为5’uaauuucuacuguuguagauuugacaaaaccuaacuugcg3’)，核酸探针(0.25μm，5’fam-ttatt-biotin3’)，25mmhepes，50mm乙酸钾，10mm乙酸镁，2mmdtt，2％peg-20000，150μmdntps，2mmatp，30mmnacl，40mm磷酸肌酸，50ng/μl肌酸激酶，rnase抑制剂(1-2μl)，待检核酸1μl。 3.将反应体系于37℃加热30分钟。 4.结果：右边除下面那一道杠外，上面还有一道杠(如箭头所指位置)，为阳性；左边仅下面有一道杠，而上面无杠(如箭头所指位置)，为阴性对照。 序列表 <110>浙江天杭生物科技股份有限公司 <120>一种简便快速检测核酸方法 <160>6 <170>patentinversion2.1 <210>1 <211>24 <212>dna <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：人工合成的序列 <400>1 ggggagtcgtcaatggttcgacac24 <210>2 <211>27 <212>dna <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：人工合成的序列 <400>2 taactccatgtgccatgtacagcagag27 <210>3 <211>40 <212>rna <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：人工合成的序列 <400>3 uaauuucuacuguuguagaucuagcggaauagcaggucuc40 <210>4 <211>19 <212>dna <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：人工合成的序列 <400>4 tccatcctggcctcgctgt19 <210>5 <211>19 <212>dna <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：人工合成的序列 <400>5 gctgtcaccttcaccgttc19 <210>6 <211>40 <212>rna <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：人工合成的序列 <400>6 uaauuucuacuguuguagauuugacaaaaccuaacuugcg40 技术特征：联系客服
