第八章 微生物的遗传变异与育种
遗传和变异是一切生物体最本质的属性之一。
4个基本概念：
（1）遗传型：或基因型，是某一生物个体所含有的全部遗传信息。是一种内在的可能性或潜力。
（2）表型：指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境条件下的具体体现。是一种现实性。
（3）变异：生物体在某种外因或内因作用下引起的遗传物质结构或数量的改变。
几率极低，新性状是稳定的，可遗传的。
（4）饰变：指外表的修饰性改变，即不涉及遗传物质结构改变。 是不遗传的
第一节 遗传变异的物质基础
核酸（尤其是DNA）才是一切生物遗传变异的真正物质基础。
一、三个经典实验
（一）经典转化实验
S型：有荚膜、菌落表面光滑、致病菌株肺炎链球菌
R型：无荚膜、菌落表面粗糙、非致病菌株
1、 Griffith（1928年）通过以下三组实验发现了转化因子
（1）动物试验
（2）细菌培养试验
3、S型菌的无细胞抽提液试验
以上三个试验说明：加热杀死的S型细菌，在其细胞内可能存在一种转化物质，能通过某种方式进入R型细胞，并使R型细胞获得稳定的遗传性状。
Avery等（1944年）离体转化试验：
目的：寻找热杀死的有毒肺炎球菌（即S菌）中究竟哪种成分与Griffith的转化有关。
方法：用水解DNA、RNA或蛋白质的酶来选择性地破坏S菌抽提物的细胞成分，然后将无毒的R菌与经过处理的抽提物混合，进行转化实验。
结果表明：
Ø 只有S型菌株的DNA才能将肺炎链球菌的R型菌株转化为S型，而且DNA浓度越高其转化效率越高。
Ø 这就有力说明，S型转移给R型的是以DNA为物质基础的遗传信息。
（二）噬菌体感染实验（1952年）
1、制备含32P核心或含35S衣壳的T2噬菌体
2、证明T2噬菌体核酸进入E.coli并参与子代的复制
3、证明T2噬菌体衣壳蛋白未进入E.coli，故未参与子代的复制
结论：在T2噬菌体浸染E.coli的过程中，侵入宿主细胞的仅是DNA；由DNA所携带的遗传信息可指导完整子代噬菌体的复制、合成和装配。
因此，T2噬菌体的DNA中存在着包含合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。
“中心法则”
（三）植物病毒的重建实验
结论：在RNA病毒中，也是由核酸而不是蛋白质作为其遗传的物质基础。
通过3个经典实验，得到一个确信无疑的共同结论：只有核酸才是负载遗传信息的真正物质基础。
第二节 基因突变和诱变育种
一、基因突变（gene mutation）
★定义：简称突变，指遗传物质核酸（DNA或病毒的RNA）中的核苷酸顺序突然发生了稳定的可遗传的变化。
可自发突变和诱发突变（诱变）。
▲野生型菌株：从自然界分离得到的菌株；
▲突变株：野生型经过突变后形成的带有新性状的菌株。
广义的基因突变包括点突变和染色体畸变两类。
点突变：一个基因内部结构或DNA序列的任何改变，发生一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换，而导致的遗传变化。
染色体畸变：DNA的大段变化（损伤）现象，表现为染色体的变化（插入、缺失、重复、易位和倒位）。
（一）突变类型
1、营养缺陷型
★定义： 野生型菌株由于发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，因而不能在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型 。
2、抗性突变型
野生型菌株由于基因突变，对某些物理化学因素产生了抗性的变异类型。
如某些致病菌对抗生素的抗性
3、条件致死突变型
菌株或病毒经过基因突变，在某一条件下能正常生长繁殖，而在另一条件下却表现出致死效应，无法生长繁殖。 如温度敏感株。
4、形态突变型
由于突变引起细胞形态或细菌菌落形态的改变。如细菌鞭毛、荚膜或芽孢的形态变化；菌落形状、大小、颜色、光滑程度等的改变。
5、抗原突变型
由于基因突变引起细胞抗原性发生改变。主要是细胞壁、荚膜、鞭毛表面成分发生细微变化。
6、产量突变型
通过基因突变获得的在有用代谢物产量上不同于原始菌株的突变株称为产量突变株。包括两类：
正突变株：代谢产物产量高于原始菌株；
负突变株：代谢产物产量低于原始菌株。
（二）突变率
Ø 某一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率，称为突变率。
Ø 突变率为10-8，表示该细胞在1亿次分裂过程中会发生1次突变，或者108个细胞的群体，当其分裂为2×108个细胞时，有一个细胞发生了突变。
Ø 基因的突变是独立发生的，相互间不产生影响。多重基因突变的几率是各个基因突变几率的乘积。如某一基因突变率为10-8，另一为10-6，则双重突变的几率为10-14。
★（三）基因突变的特点
1、自发性
各种性状的改变，可在没有人为诱变因素处理下自发发生。
2、不对应性
指突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。
3、稀有性
自发突变的频率是较低和稳定的，一般在10-6 ~ 10-9之间。
4、独立性
某基因的突变率不受其它任何基因的突变的影响。
例如，在某一群体中，既可发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉素的突变型，而且还可发生其它任何性状的突变型。
5、诱发性
通过诱变剂的作用，可提高自发突变的频率，一般可提高10~105倍。
6、稳定性
由于突变的根源是遗传物质结构上发生了稳定的变化，所以产生的新性状也是稳定的、可遗传的。
7、可逆性
由原始的野生型基因变异为突变型基因的过程，称为正向突变。相反的过程则称为回复突变。
实验证明，任何性状都可以发生正向突变，也都可发生回复突变。
（四）基因突变自发性和不对称性的实验证明
1、Luria等的变量试验
2、Lederberg等的影印平板培养法
3、Newcombe的涂布试验
证明了突变的自发性。
（二）诱变育种
★定义：指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞，提高基因的随机突变频率，然后通过一定的筛选方法获得所需要的优质菌株。
1、诱变育种的基本环节
▲诱变和筛选是两个主要环节，其中筛选显得更为重要。
以选育高产突变株为例：
2、诱变育种的几个原则
（1）选择简便有效的诱变剂
物理因素：非电离辐射类的UV、激光、离子束；电离辐射类的Χ射线、γ射线和快中子等。
UV：15 W，30 cm，无可见光，10~20s至20min。
化学因素：烷化剂、碱基类似物、吖啶化合物。
最常用的烷化剂有NTG（亚硝基胍）、EMS（甲基磺酸乙酯）、NMU（甲基亚硝基脲）、DES（硫酸二乙酯）、氮芥、环氧乙酸等。 方法：p216
“三致”：致突变、致畸变、致癌变。
黄曲霉毒素、反应停、奶油黄、二噁嘆、苏丹红等。
艾姆氏实验：检测环境或食品中是否存在化学致癌物。 课本p215
优点（相对于动物实验）：耗时短（约3d），准确率>85，经济简便。
★习题：试述用艾姆氏(Ames)法检测致癌剂的理论依据、一般方法及其优点 。
（2）挑选优良的出发菌株
出发菌株：用于育种的原始菌株。 靠经验
（3）处理成单细胞（或单孢子）悬液
一方面，分散状态的细胞可以均匀接触诱变剂；另一方面又可避免长出不纯菌落。
“表型延迟”
∴尽量选用单核细胞，例如霉菌和放线菌的分生孢子、细菌的芽孢等。
（4）选用最适的诱变剂量
凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促进变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。
课本p217 图 7-16
剂量—存活率曲线、剂量—突变率曲线。
宜采用较低剂量
（5）充分利用复合处理的协同效应
同一诱变剂的的重复使用，多种诱变剂的同时使用，多种诱变剂的先后使用，对育种有利。
（6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标
透明圈、变色圈、显色圈、制菌圈、生长圈、水解圈、沉淀反应圈等。
（7）设计高效筛选方案
负变占多数 初筛（以量为主）、复筛（以质为主）。
（8）创造新型筛选方法
初筛和复筛结合
3、三类突变株的筛选方法
(1)产量突变株的筛选
| 涂布 |
（2）抗药性突变株的筛选
梯度平板法
（3）营养缺陷型突变株的筛选
★ ① 与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基
基本培养基/基础培养基（MM，符号[-] ）：仅能满足某M.B的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基。
注意：有的MM成分并不简单，甚至可能含有生长因子。
完全培养基（CM，符号[+] ）：可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基。
补充培养基（SM）：只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基。在[-]上添加相应营养物。
▲② 与营养缺陷型突变株有关的三类遗传型个体
野生型：从自然界分离得到的菌株 。 能在相应的[-]上生长。
营养缺陷型：野生型菌株经诱变处理后，由于丧失了合成一种或几种生长因子的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的突变菌株 。 A-
不能在[-]上生长，只能在[+]或相应的SM上生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株。 能在相应的[-]上生长。
③ 营养缺陷型突变株的筛选方法
▲四步：诱变、淘汰野生型、检出、鉴定营养缺陷型
Ø 诱变：用诱变剂处理。
Ø 淘汰野生型：
抗生素法原理：抗生素能杀死在[-]上生长繁殖的野生型，而不能在[-]上生长繁殖的处于休眠状态的营养缺陷型被保留了下来。
菌丝过滤法原理：将经诱变剂处理过的大量孢子置于[-]上培养一段时间（野生型能发芽成菌丝，而营养缺陷型不能），然后用擦镜纸过滤，反复数次可除去野生型。
Ø 检出缺陷型
夹层培养法、逐个检出法等。
Ø 鉴定缺陷型：生长谱法。
第三节 基因重组和杂交育种
▲定义：两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程，称为基因重组。
重组是在核酸水平上的一个概念，是遗传物质在分子水平上的杂交。一般说的杂交是细胞水平上的。
基因重组是杂交育种的理论基础。
一、原核生物的基因重组
特点：
① 片段性：仅一小段DNA序列参与重组。
② 单向性：从供体菌到受体菌（或从供体基因组向受体基因组）作单向转移。
③ 转移机制独特而多样：有转化、转导和接合等。
（一）转化
1、定义
受体菌直接吸收供体菌的DNA片段，通过交换，把它整合到自己的基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用。
通过转化方式而形成的杂种后代称为转化子。
2、转化微生物的种类
普遍。如肺炎链球菌、芽孢杆菌属、假单胞菌属、黑曲霉、酿酒酵母等。
但是E.coli 很难进行转化，需要经特殊处理。
3、感受态
★定义：是指受体细胞最容易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。
研究发现，凡能发生转化，其受体细胞必须处于感受态。
4、转化因子
转化因子的本质是离体的DNA片段。约含15个基因。
ssDNA和dsDNA形式的转化因子均能进入感受态细胞，视菌种而定，但最易与细胞表面结合的是dsDNA片段。
5、转化过程
6、转染
如果把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染宿主细胞，繁殖产生正常的噬菌体或病毒后代，这种现象称为转染。
它与转化不同之处在于病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌，中间也不发生任何遗传因子的交换或整合，最后也不产生具有杂种性质的转化子。
（二）转导
定义：通过缺陷噬菌体作媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得供体部分遗传性状的现象，称为转导。
由转导作用而获得部分新性状的重组细胞，称为转导子。
转导的种类有普遍转导、局限转导和溶源转变等。
1、普遍转导
通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传给受体菌的现象，称为普遍转导。
普遍转导包括完全普遍转导和流产普遍转导。
完全普遍转导：噬菌体误包入供体菌DNA片段，形成完全不含本身DNA的假噬菌体（一种完全缺陷噬菌体），感染受体菌后，受体不会裂解。导入的DNA片段与同源区配对，通过两次交换而重组到受体菌DNA上，形成稳定转导子。
流产普遍转导：经转导噬菌体的媒介而获得供体菌DNA片段的受体菌，如果外源DNA在其内不能进行重组和复制，仅表现为稳定的转录和表达。
2、局限转导
指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。
产生机制：不正常切离 。温和噬菌体整合到受体菌DNA特定位点上，诱导裂解时，在插入位点两侧的少数宿主基因会因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上，一起包入噬菌体中，形成部分缺陷噬菌体。
（1）低频转导
频率为10-4~10-6
（2）高频转导
频率约50%
3、溶源转变
当正常的温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主的核基因组上，而使宿主获得了除免疫性外的新遗传性状的现象，称为溶源转变。
与转导本质上不同，噬菌体不携带任何供体菌基因，是完整的，而非缺陷的。 获得的新性状可随噬菌体的消失而消失。
（三）接合
1、定义
供体菌（“雄性”）通过性菌毛与受体菌（“雌性”）直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为接合。也称杂交。
通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，称为接合子。
2、能进行接合的微生物种类
主要在细菌和放线菌中存在。细菌中，大肠杆菌研究得最清楚。
3、E. coli的四种接合型菌株
F+菌株、F-菌株、Hfr菌株、Fˊ菌株。
（1）F+菌株
是雄性菌株。细胞内含一至几个F质粒（游离状态），并在细胞表面着生一条至几条性菌毛的菌株。
（2）F-菌株
是雌性菌株。细胞内无F质粒，细胞表面也无性菌毛的菌株。
（3）Hfr菌株/高频重组菌株
细胞内有F质粒，但F质粒与核染色体的特定位点整合成整合状态，而非游离状态。
（4）Fˊ菌株
Hfr菌株细胞内的F质粒因不正常切离而脱离核染色体组时，可重新形成游离的、但携带有整合位点邻近一小段核染色体基因的特殊F质粒。 课本p230图7-27
（四）原生质体融合
1.定义：通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的
原生质体发生融合，以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。又称细胞融合。
2.特点：杂交频率高（达10-1，一般诱变育种仅为10-6 ）；遗传物质传递更完整；原生质体较容易进行转化，可用于工业微生物育种工作。
3.方法是先用酶降解掉两个出发菌株的细胞壁，在高渗透压环境中释放出原生质，将它们混合，在助融剂或电场的作用下互相凝集而发生细胞融合，实现遗传重组。
4. 主要步骤
（1）原生质体制备
选择菌株。作为育种菌株须：①具有良好生产性状；②具有一些稳定的明显的遗传标记。
破壁：放线菌和细菌一般用溶菌酶，酵母和霉菌一般用蜗牛酶或纤维素酶。
得到原生质体。离心收集。
（2）原生质体融合
加入促融合剂—聚乙二醇（PEG）及Ca2+、Mg2+，使原生质体表面形成电极性，相互易于吸引，形成聚集物。UV、电场、激光等技术可应用。
（3）再生成正常细胞
融合后的原生质体不具细胞壁，不能在普通培养基上增殖，无法表现，必须使其重新形成壁。再生培养基必须具有与原生质体体内相同渗透压，常用含Ca2+、Mg2+及渗透压稳定剂的完全培养基。
（4）检出融合细胞
在选择性培养基上检出。
二、真核生物的基因重组
（一）有性杂交
（二）准性杂交
1、定义
2、准性生殖过程
3、准性杂交育种
第四节 基因工程
一、基因工程定义（Gene Engineering）
基因工程：是一种DNA的体外重组技术，是根据人们的需要，在分子水平上用人工方法取得供体DNA上的基因的技术。 也被称为分子无性繁殖或分子克隆。
通过基因工程改造后的菌株被称为“基因工程菌”，简称“工程菌”。
二、基因工程的基本操作
（一）目的基因的取得
（二）优良载体的选择
（三）目的基因与载体DNA的体外重组
（四）重组载体导入受体细胞
（五）重组受体细胞的筛选和鉴定
（六）“工程菌”或“工程细胞”的大规模培养
1、为什么要有“目的基因的获取”这一步？
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性 。
2、为什么要有“表达载体的构建”这一步？
单独的DNA片段──目的基因是不能稳定遗传的。构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。
3、为什么要有“目的基因导入受体细胞”这一步？
含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化 。
4、为什么要有“目的基因的检测与鉴定”这一步？
因为目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。
三、基因工程的应用
（一）在生产多肽类药物、疫苗中的应用
（二）改造传统工业发酵菌种
（三）动、植物特性的基因工程改良
（四）基因工程在环境保护中的应用
第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、微生物菌种的衰退
菌种衰退：指由于自发突变而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。
1. 菌种衰退的原因
（1）菌种保藏方法不当
（2）菌种的生长条件没达到最佳
（3）自发突变: 10-6 ~10-9
（4）回复突变 a. 减少传代次数 b.菌种保藏条件
2. 菌种性能的改变
（1）菌种遗传特性的改变
原因有三：① 异核现象导致M.B群体发生变异；
② 自发突变导致菌种遗传特性改变；
③ 回复突变
（2）菌种生理状况的改变
M，培养条件如T、通风等。
菌种衰退的表现或不良影响：产物产量下降、发酵周期延长、营养物消耗变慢、菌体生长繁殖力下降，抗不良环境（抗噬菌体，抗低温）能力减弱等。
3. 防止菌种衰退的措施
（1）控制传代次数
一方面，尽量避免不必要的移种和传代；另一方面，将必要的传代降低到最低次数。
（2）提供良好的培养条件
适合菌种的生长条件，可在一定程度上防止衰退。
（3）菌种的复壮
狭义的复壮 广义的复壮
（4）利用不容易衰退的细胞传代
对于放线菌和霉菌：孢子
（5）用优良的保藏方法
二、菌种的复壮
菌种复壮：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性。
狭义的复壮：
广义的复壮：
1. 纯种分离
2. 通过宿主体复壮
寄生性的M.B
3. 淘汰已衰退的个体
三、菌种的保藏
目的：不死，不衰，不被污染，便于研究、交换使用
机构：例如中国的CCCCM、CCTCC，美国的ATCC。
▲1. 菌种保藏的原理
挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（如孢子、芽孢），创造一个使微生物代谢不活泼、生长受抑制的环境条件（如干燥、低温、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等），使微生物在保藏中不增殖，也就很少发生突变。
2. 菌种保藏的方法
（1）斜面冰箱保藏法
菌种接种在斜面上，待菌种生长丰满后，将发育到对数生长期末期的菌停止培养，送入保藏。置４℃左右冰箱保藏（保持在休眠状态，控制其生长发育），保藏期一般为1~3个月，到期后必须重新转接再保藏，如此连续不断。
广泛用于细菌、放线菌、酵母、丝状真菌等各种菌的保藏。
优点：操作简单、费用低
缺点：短期内多次传代易引起菌种发生变异和退化，染菌的机会也增加。
（2）液体石蜡封存保藏法
高出斜面顶端1cm，减少水分蒸发，隔绝空气，直立， ４℃左右冰箱，保存期约1年。
缺点： 对能利用石蜡油作为C源的菌种不合适
（3）固体曲保藏法
适用于产孢子的真菌，关键是控制适当的水分。保存期1~3年。
（4）砂土管保藏法
主要步骤：① 砂土制备、灭菌；② 菌液制备；③ 砂土菌种管制备；④ 真空抽干即成砂土管菌种。
无营养、缺氧、干燥。 适用于产孢子（芽孢）微生物，保存期1年
（5）冷冻干燥保藏法
优点：具备低温、真空（隔绝氧气）和干燥三种保藏条件。可保存5~10年。
* 这些条件下微生物易失活，需加保护剂。 保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。
（6）液氮超低温保藏法
将要保存的菌种置于20%甘油或DMSO保护剂中，密封于安瓿瓶内，先将菌液降温至0 ℃，再以每分钟降低1 ℃的速度，一直降到-35 ℃，然后将安瓿瓶放入液氮罐中保存。可达-196℃。保存期20年以上。
几种常用菌种保藏方法的比较：p244 表7-13
液氮超低温保藏法的效果最好。
▲简述菌种保藏的基本原理，列出四种保藏方法。
